분열 효모의 양적 라이브 세포 형광 - 현미경 분석

다음 실험의 전반적인 목표는 효모 세포 내의 핵 하부 구조를 정량적으로 측정하고, 성장 조건의 변화나 돌연변이에 의해 이것이 어떻게 영향을 받는지 확인하는 것입니다. 이를 위해 자가형광을 최소화하는 조건에서 효모 세포를 대수 성장기까지 배양합니다. 그 다음, 세포를 성장 챔버에 넣고 현미경으로 관찰합니다.

그런 다음 이미지를 촬영하여 세포 내 서로 다른 형광 표지 구조 사이의 거리를 측정합니다. 그 결과, 효모 배양 중 영양 조건을 변경함에 따라 비핵 조직에 차이가 나타남을 확인할 수 있습니다. 이 방법은 하위 핵 조직 또는 염색질과 유전자 조절 사이의 상호 작용에 관한 후성유전학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

물고기 및 효모 실험은 먼저 에든버러 최소 배지(Edinburgh minimal medium, EMM) 또는 자가형광을 줄이기 위해 염화암모늄을 첨가한 EMM을 준비하는 것으로 시작하며, 이때 고압 증기 멸균법 대신 다른 방법을 사용합니다. 0.2 micron 필터를 사용하여 포도당 용액을 멸균한 후, 고압 증기 멸균된 배지에 첨가합니다. 30 milliliter 튜브에 담긴 3 milliliters의 EMM에 물고기 및 효모 세포를 접종합니다.

YEA 풍부 배지가 도포된 한천 배지에서 갓 배양한 세포의 튜브 캡을 가볍게 닫고, 225 RPM, 30 °C 조건의 진탕 배양기에서 배양합니다. 매일 아침과 저녁에 Birka chamber로 세포 수를 측정하고 적절한 밀도로 희석하여, 이틀 동안 세포를 로그 단계(log phase)로 유지합니다. 실험 당일에,

세포는 질소 결핍 상태의 초기 대수 성장기 단계여야 합니다. 서면 프로토콜에 명시된 절차에 따라, 먼저 튜브를 2분간 원심 분리한 다음 180도 회전시켜 추가로 2분간 원심 분리하여, 1.5 mL 원심 분리 튜브 바닥에 세포를 하나의 펠렛으로 수집합니다. 이때 최대 원심력은 1.5 RCF로 설정합니다. 상층액을 10~15 µL만 남기고 모두 제거한 뒤, 남은 배지에 세포를 재현탁하고 1 mg/mL의 필터 멸균된 lectin 분주액을 첨가합니다.

커버글라스 모서리에 렉틴 용액 5 µL를 가하고, 렉틴 방울에 배양액 5 µL를 추가합니다. S pom 기저 세포의 성장 챔버를 만들기 위해, 깨끗한 슬라이드 위에 EMM 5 µL를 피펫으로 분주하고 배양액이 담긴 커버글라스를 배지 위로 70도 각도로 뒤집어 EMM 위에 수직으로 내려놓은 뒤 실리콘 그리스로 가장자리를 밀봉합니다. 200 µL 팁의 넓은 끝부분을 자르고 좁은 끝부분을 2 mL 주사기에 연결합니다.

시린지에 실리콘 그리스를 약 1 mL 채웁니다. 시린지의 피스톤을 부드럽게 밀어 커버글라스의 가장자리에 실리콘을 얇게 도포하여 배양 챔버를 밀봉합니다. 먼저 명시야 이미징(Brightfield Imaging)을 사용하여 세포의 위치를 찾고 굴착을 시작합니다.

공초점 현미경으로 선명한 이미지를 얻으십시오. 본 실험에서는 plan apoch chromat 63배 오일 대물렌즈와 16라인 평균 평면 스캔 설정이 적용된 Zeiss LSM 700 레이저 스캐닝 현미경을 사용합니다. 0.8 µm의 광학적 절편(optical slice)을 얻으려면 영역 단위를 1:1.1로 설정하십시오.

Alexa 4 88 및 mCherry 또는 GFP를 검출하는 레이저로 세포를 스캔하십시오. 각 배수구당 60개의 세포를 측정할 수 있도록 충분한 이미지를 기록하십시오. 새로운 세포가 들어 있는 새 배양 챔버로 교체하십시오.

60분 동안의 이미징 후, Zeen Light Edition 프로그램을 통해 이미지를 열어 동일한 초점 평면 내에서 서로 다른 형광체 신호 사이의 거리를 측정합니다. 측정 도구를 열고 광도와 대비를 조절하여 방추사 극체(spindle pole body)와 핵막(nuclear membrane) 등 각 형광 신호의 중심을 확인한 뒤, 그 사이의 거리를 측정합니다. 측정된 데이터를 메모장에 기록합니다.

통계 소프트웨어나 T-검정(T-test) 또는 맨-휘트니 순위합 검정(Man Whitney Rank sum test)과 같은 통계 테스트를 사용하여 서로 다른 균주 및 처리군 간의 평균 또는 중앙값 세포 내 거리를 비교하십시오. 본 예시에서는 PJ 1 18 5 균주를 EMM에서 배양한 후, 이미징을 위해 샘플을 성장 챔버에 넣었습니다. 그 다음 PJ 1 18 5의 분주액을 사용하였습니다.

배양물을 EMMN으로 옮겨 15분 동안 배양한 후, 시료를 이미징을 위한 성장 챔버에 넣었습니다. 측정 도구를 사용하여 유전자 궤적(locus)과 방추체 극체(spindle pole body) 사이의 거리와 유전자 궤적과 핵막 사이의 거리를 측정하였습니다. 여기에서 알 수 있듯이, 질소가 공급된 상태에서 성장한 세포와 비교했을 때, 질소가 결핍된 세포에서는 유전자 클러스터가 핵막에서 멀어져 방추체 극체 방향으로 이동하는 거리에 통계적으로 유의미한 차이가 있었습니다.

GFP와 SBP 사이의 거리를 측정한 데이터는 정규 분포를 나타냈으므로, T-검정을 사용하여 평균 거리를 비교할 수 있었습니다. 두 평균값 사이에는 유의미한 차이가 있었습니다. GFP와 NM 사이의 거리를 측정한 데이터는 정규 분포를 나타내지 않았으므로, 맨-휘트니 순위합 검정을 사용하여 중앙값 거리를 비교하였습니다.

이 절차를 수행한 결과, 두 중앙값 사이에 유의미한 차이가 있었습니다. 유전자 발현 수준이 핵 내 구조의 변화와 어떻게 상관관계가 있는지에 대한 추가적인 질문에 답하기 위해 실시간 PCR과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.