혈관 CA의 시각화 ^{2 +} Paracrine 유래 ROS에 의해 트리거된 신호

이 프로시저의 전반적인 목표는 페리크린(pericrine) 유래 활성 산소종(reactive oxygen species) 또는 ROS에 의해 유발되는 혈관 칼슘 신호 전달을 시각화하는 것입니다. 이는 먼저 활성 대식세포에서 산화 민감성 염료를 사용하여 ROS를 시각화함으로써 수행됩니다. ROS는 또한 플라스미드 기반 형광 센서를 사용하여 혈관 내피세포에서도 시각화할 수 있습니다.

그런 다음, 공배양 모델에서 cell tracker red로 표지된 활성화된 대식세포와 flu of four로 표지된 혈관 내피세포를 동시에 시각화합니다. 마지막으로, 공초점 이미징 시스템을 사용하여 대식세포 유래 ROS에 의해 유발된 혈관 내피세포의 칼슘 신호를 측정합니다.

이러한 결과는 ROS 수준을 독립적으로 입증할 수 있을 뿐만 아니라, Peregrine 유래 ROS에 의해 유발된 세포 내 칼슘 동원을 동시에 평가할 수 있음을 보여줍니다. 이 방법은 혈관 신호 전달 및 시뮬레이터 병태생리학적 환경을 밀접하게 유발하는 두 가지 서로 다른 신호 분자를 동시에 평가할 수 있게 합니다. 저희 연구실의 두 박사후 연구원인 Karthik과 Raj가 ROS 및 칼슘 측정, 그리고 대식세포와 내피세포의 상호작용에 대한 절차를 시연할 것입니다.

유리 바닥의 35 millimeter 디쉬에서 마우스 단핵구 유래 대식세포를 배양합니다. 그 다음 toll-like receptor 작용제로 세포를 자극하고 37 °C에서 6시간 동안 배양합니다. 세포질의 시각화를 위해.

ROS 산화 민감성 염료를 첨가하고 세포를 20분 동안 배양합니다. 이제 공초점 이미징 시스템의 온도 조절 스테이지에서 세포를 시각화합니다. 또는, TLR 활성화 세포 내의 미토콘드리아 ROS를 시각화하려면 미토콘드리아 슈퍼옥사이드 표시자를 첨가하고 37 °C에서 세포를 30분 동안 배양합니다.

음성 대조군으로는 PBS를 처리하고, 양성 대조군으로는 2 mM antimycin을 처리합니다. 이후 온도 조절 스테이지가 장착된 공초점 이미징 시스템에서 모든 세포를 시각화합니다.

Image J 소프트웨어를 사용하여 모든 이미지 데이터를 분석하십시오. 형광 센서는 서브 마이크로몰 농도의 과산화물을 매우 특이적으로 감지하며, 포유류 발현을 기반으로 벡터 설계를 통해 세포질 또는 미토콘드리아로 타겟팅할 수 있습니다. 전기천공법을 사용하여 부적절한 과발현 플라스미드를 보유한 마우스 폐 미세혈관 내피세포의 안정적 세포주를 제작하십시오.

콜로니 성장을 촉진하기 위해 세포를 낮은 밀도로 complete TMEM에 플레이팅하고 48시간 동안 배양한 후, 배지를 선택 항생제가 첨가된 완전 배양 배지로 교체합니다. 하이퍼 양성 세포의 비율이 가장 높은 클론을 선별하고, 배양물을 증폭하여 개별 실험에 사용할 안정적인 하이퍼 양성 라인을 구축합니다. 세포를 0.2% 젤라틴 코팅된 커버슬립에 접종하고 80% 합류도(confluence)에 도달할 때까지 하룻밤 동안 배양합니다.

이제 TLR 리간드로 세포를 활성화하고 37 °C에서 6시간 동안 배양합니다. 세포질 내 ROS를 검출하기 위해, 세포가 부착된 커버슬립을 adelo cell chamber에 장착합니다. 미리 데워둔 한- saline-buffered salt solution 1 mL를 첨가하고, 챔버를 공초점 이미지 시스템의 온도 조절 스테이지 위에 올립니다.

미토콘드리아 ROS 검출을 위해 세포의 형광 변화를 기록하십시오. 2 µM antimycin A를 양성 대조군으로 포함하십시오. 그런 다음 처리된 세포의 커버슬립을 준비하여 공초점 현미경 관찰을 수행하십시오. Image J 소프트웨어를 사용하여 이미지 분석을 수행하십시오.

세포 내 칼슘 변화를 시각화하고 측정하기 위해, 젤라틴 코팅된 유리 커버슬립 위에서 80% 합류도(confluence)까지 성장시킨 혈관내피세포를 준비합니다. 염료 손실을 최소화하기 위해 실온에서 형광 염료인 fluo-4 AM으로 30분 동안 세포를 배양합니다. 그 후 suen pyro zone이 포함된 실험용 이미징 솔루션으로 세포를 세척합니다. 이제 커버슬립을 adelo 셀 챔버에 장착하고, 미리 데워둔 실험용 이미징 솔루션 800 µL를 첨가한 뒤, 별도의 튜브에 담긴 세포를 공초점 이미징 시스템의 온도 조절 스테이지 위에 배치합니다.

조사 대상인 대식세포 집단을 표지하기 위해 500 ng/mL의 cell tracker red C-M-T-P-X를 15분 동안 처리한 후, 세포를 세척하고 펠릿을 200 µL의 실험용 이미징 솔루션에 재현탁합니다. 이제 표지된 대식세포를 flu oh 4:00 AM이 로딩된 공초점 챔버 어셈블리의 내피세포 위에 첨가합니다. 10분 동안 3초 간격으로 녹색 및 적색 형광을 기록합니다.

본 실험에서는 J 7 74 0.1 세포에 TLR 2, 3, 4 리간드를 6시간 동안 처리하였습니다. 대표적인 공초점 이미지에서 DCF로 측정한 세포질 ROS의 증가가 나타납니다. 흥미롭게도, MitoSOX Red 형광은 미토콘드리아 ROS 또한 유사하게 증가했음을 보여줍니다.

이러한 형광 변화는 정량적입니다. 따라서 결과는 정규화되어 처리당 상대적 배수 변화로 표현되어야 하며, antimycin a 신호는 미토콘드리아 ROS 생성에 대한 양성 대조군을 입증합니다. 이 그림은 hyper cyto 또는 hyper D mito를 안정적으로 발현시킨 세포의 내피, 세포질 및 미토콘드리아 과산화물 수준의 이미지를 보여줍니다.

TLR 작용제로 자극된 MP ECS. 평균 형광 변화의 정량 분석 결과, 공동 배양 시스템에서 6시간의 자극 후 hyper cyto 및 hyper D mito 형광이 증가함이 확인되었습니다. Peregrine ROS 신호 전달을 평가하기 위해, 야생형 및 GP 91 Fox null 마우스에서 갓 분리한 mirin 대식세포를 1 µg/mL의 LPS로 6시간 동안 활성화했습니다.

대식세포를 C-M-T-P-X로 적색 표지하여 녹색 형광이 로딩된 MPM ecs에 첨가하였습니다. 흥미롭게도, 야생형 생쥐에서 분리된 LPS 활성 대식세포는 GP 91 Fox null 생쥐 유래 대식세포에 비해 MPM ECS에서 크고 빠른 칼슘 동원을 유발했습니다.

이 절차를 시도할 때, 장시간의 다운로딩이나 레이저 노출이 DCF의 자동 산화를 유발할 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. Hyper Cyto 및 Hyper D Mitral의 광퇴색을 방지하는 것이 매우 중요합니다. 숙달되면 대식세포뿐만 아니라 혈관 내피세포에서의 RA 측정은 적절히 수행될 경우 7시간 이내에 완료할 수 있습니다.