마그네틱 족집게를 사용하여 다중 단일 분자 강제 Proteolysis 측정

이 절차의 전반적인 목표는 고도로 병렬적이고 비용 효율적인 방식으로 단일 단백질의 단백질 분해 절단에 미치는 기계적 부하의 영향을 연구하는 것입니다. 본 시연에서는 matrix metalloproteinase one에 의한 콜라겐의 절단을 조사하며, 첫 번째 단계로 유동 셀(flow cell)의 유리 커버슬립에 콜라겐 트리머를 부착한 후, 개별 콜라겐 분자에 마이크로미터 크기의 자기 비드를 부착합니다. 두 번째 단계는 유동 셀을 자기 핀셋(magnetic tweezers) 장치에 장착하고 비특이적으로 부착된 비드들이 커버슬립 표면에서 제거되었는지 확인하는 것입니다.

다음으로, 프로테아제를 유동 셀(flow cells)에 첨가합니다. 마지막 단계는 비드의 탈착을 실시간으로 모니터링하여 단백질 분해 속도를 결정하는 것입니다. 다양한 프로테아제 농도와 힘에서 비드 탈착 속도를 측정함으로써, 극소량의 기질과 프로테아제를 사용하여 표준 동물학적 반응 속도론 파라미터를 도출할 수 있습니다.

또한, 이 기술은 기계적 힘이 단백질 분해 속도와 절단 시 수반되는 기질 단백질의 구조적 변화에 미치는 영향에 관한 고유한 정보를 제공합니다. 광학적 T trace 및 원자 힘 현미경과 같은 다른 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 고속 처리(high throughput)가 가능하며 비용 효율적이라는 점입니다. 이 방법은 단일 단백질의 단백질 분해 절단에 작용하는 유효한 힘에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 해당 장비와 기술을 단백질 접힘 및 구조에 힘이 미치는 영향을 포함한 광범위한 생물물리학적 문제에 적용할 수 있습니다.

초음파 세척을 통해 커버 슬립을 세척하여 플로우 셀 준비를 시작합니다. 커버 슬립을 초음파 세척기에 들어갈 수 있는 작은 유리 용기에 넣습니다. 용기에 이소프로판올을 채우고 배스형 초음파 세척기에서 20분 동안 처리한 후, 이소프로판올을 제거하고 커버 슬립을 다량의 탈이온수로 헹굽니다.

용기에 물을 채우고 20분 동안 초음파 처리합니다. 초음파 처리 후, 여과된 먼지 없는 공기 흐름으로 커버슬립을 건조시킵니다. 커버슬립을 검사하여 얼룩이 없는 것들만 사용하십시오.

커버슬립을 분젠 버너의 가스 불꽃에 통과시켜 몇 초간 살짝 가열함으로써 잔류 먼지와 수분을 제거합니다. 이때 과도한 열로 인해 커버슬립이 변형되지 않도록 주의하십시오. 이 단계는 표면의 잔류 오염 물질을 제거하기 위한 것입니다.

다음으로, 양면 테이프를 사용하여 커버슬립 두 개를 서로 부착합니다. 먼저 테이프를 길이 약 3cm, 너비 0.3cm로 자른 후, 22 x 40mm 커버슬립에 부착하며 이때 중앙에 1.6cm의 채널을 남겨둡니다. 피펫 팁을 사용하여 커버슬립을 가볍게 눌러 테이프가 제대로 접착되었는지 확인합니다.

자기 집게 장치는 이 실험실에서 1mm 직경의 핀홀이 있는 알루미늄 L 브래킷을 사용하여 제작되었으며, 집게의 높이를 조절하기 위해 수직 Z 축 이동 장치(Z translator)에 장착되었습니다. 자기장 구배를 생성하기 위해 핀홀 양측의 브래킷에 두 개의 영구 희토류 자석을 부착하였습니다. 이 절차에서는 자기 트랩의 적절한 보정이 필수적입니다.

성공적인 실험을 위해 본 섹션에서 설명하는 두 가지 서로 다른 방법을 사용합니다. 자기 트랩을 보정하기 위해, 서면 프로토콜에 기술된 대로 5' 말단과 3' 말단이 각각 비오틴과 옥시게닌으로 라벨링되어 미리 준비된 람다 파지의 DNA를 사용하십시오. DNA를 플로우 셀에 부착하려면, 먼저 플로우 셀을 항-옥시게닌 항체 용액으로 채우고 항체가 유리 표면에 부착될 수 있도록 15분 동안 유지하십시오.

다음으로, BSA 용액을 플로우 셀에 첨가하여 DNA의 비특이적 부착을 방지하기 위해 플로우 셀 표면을 블로킹합니다. 이 블로킹 단계와 이후의 모든 단계에서 플로우 셀에 첨가하는 시약의 부피는 플로우 셀 부피의 최소 2배가 되어야 함에 유의하십시오. 본 시연에서 플로우 셀의 부피는 75 microliters이며, 플로우 셀을 상온에서 45분 동안 배양합니다.

이 단계를 반복한 후, 50 pM의 기능화된 lambda DNA를 첨가하고 15분 동안 커버 슬립에 부착되도록 합니다. 그 후 1x PBS로 과잉 DNA를 씻어냅니다. 마지막으로, streptavidin이 코팅된 초상자성 비드를 첨가하고 고정된 DNA에 15분 동안 부착되도록 합니다. 본 시연에서는 2.8 µm 비드가 사용되었습니다.

XPBS 1회 분량으로 과잉 비드를 씻어냅니다. 다음으로, 영구 자석을 시료 표면에서 멀리 떨어진 위치로 이동시켜 자기 집게(magnetic tweezers) 보정을 수행합니다. 그런 다음 준비된 플로우 셀을 현미경에 배치합니다.

영구 자석을 플로우 셀 상단의 정해진 위치로 이동합니다. 양쪽 유리 표면에서 떨어진 비드를 포커싱하여 Lambda DNA로 기능화된 비드의 초점 평면을 선택합니다. 올바른 초점 평면은 대상 비드의 중심부가 밝게 보이는 평면입니다.

80 Hz 이상의 주파수로 500 프레임 동안 비드 움직임을 촬영하십시오. 자석을 시료 표면에 더 가까이 이동시키며 각 위치에서 비드의 움직임을 비디오로 기록하십시오. 5 mm 이상의 거리에서는 1 mm 간격으로 이동하고, 1 mm에서 5 mm 사이의 거리에서는 더욱 세밀한 간격으로 이동하십시오.

1mm 미만의 거리에서는 0.5mm 간격으로 이동하고, 그 이하에서는 0.25mm 간격으로 이동하십시오. 각 데이터 세트에 대해 2D 가우시안 피팅(Gaussian fit)을 사용하여 비드의 중심을 추적하십시오. 서면 절차에 기술된 대로 브라운 운동 요동(brownian fluctuations)을 통해 힘을 계산하십시오. 파워 스펙트럼 선형 피팅(power spectrum linear fit)을 통한 힘 계산 값을 확인하여 힘의 정확도를 검증하십시오.

차단 주파수를 구하기 위해, 가해진 힘과 차단 주파수 사이의 관계는 흐름 셀(flow cell)에 콜라겐 펩타이드 부착 전 단계의 텍스트에서 확인할 수 있으며, 콜라겐 펩타이드와 MMP one 단백질을 발현 및 정제하십시오. 먼저 anti mic 항체 용액을 흐름 셀에 넣고 실온에서 20분 동안 배양하여 anti mic가 흐름 셀 표면에 부착되도록 합니다. 5 mg/mL BSA를 사용하여 단백질의 비특이적 부착을 방지하기 위해 흐름 셀을 블로킹하십시오. 150 pM 콜라겐 펩타이드를 첨가하고 M ttag를 통해 항체에 45분 동안 부착되도록 합니다.

플로우 셀에 2.8 µm 비즈를 추가하기 전, PBS 버퍼를 사용하여 과량의 콜라겐을 씻어냅니다. 비즈는 강력한 자석을 사용하여 strep divid 및 코팅 비즈 용액으로부터 분리한 후, PBS에 재현탁해야 합니다. 이 과정을 세 번 반복합니다.

이 단계는 2.8 µm 비즈가 표면에 고정된 콜라겐 펩타이드에 결합하도록 하는 데 필수적입니다. 다음으로, streptavidin이 코팅된 초상자성 비즈를 추가하고 콜라겐 분자에 부착될 수 있도록 45분 동안 유지합니다. 콜라겐 펩타이드와 자성 비즈로 플로우 셀 조립이 완료되면, 자기 트랩 내에서 플로우 셀을 이미징합니다.

낮은 힘에서는 비드의 일부 하위 집단이 비특이적인 방식으로 표면에 부착되어 약하게 결합하는 경우가 있습니다. 적절한 힘을 가함으로써 이러한 비드들이 분리되도록 합니다. 활성화된 효소를 플로우 셀에 첨가합니다.

본 사례에서는, 3.5 mM PMA를 첨가하여 MMP 1을 사전 활성화한 후 37 °C에서 3시간 동안 배양하였습니다. 플로우 셀을 자기 핀셋 장치에 다시 장착하는 즉시, 일반적으로 수백 개의 부착된 비드가 포함되는 몇 개의 시야 영역에 걸쳐 비디오를 기록합니다. 이 측정 시점이 시간 t=0에 해당합니다.

모든 비드가 분리되거나 더 이상 단백질 분해가 관찰되지 않을 때까지 정해진 시간 간격으로 여러 시야를 기록하는 과정을 반복합니다. 마그네틱 트위저는 1 µm 및 2.8 µm 비드에 대해 교정되었습니다. 강제 단백질 분해 실험에서 관찰된 브라운 변동의 크기와 다양한 자석 위치에서의 롤오프 주파수 계산을 모두 사용하여, 남아 있는 비드의 정규화된 수를 시간의 함수로 도식화함으로써 단백질 분해 속도를 구할 수 있습니다.

이 과정은 다양한 효소 농도와 힘에 대해 반복할 수 있습니다. 단백질 분해 속도는 가해진 힘에 따라 달라집니다. 단백질 분해 속도는 1 pN, 6.2 pN, 그리고 13 pN에서 측정되었습니다.

15분 이후에 unfolding되지 않은 비드의 분율은 서로 다른 실험 전반에 걸쳐 약 0.25로 일정하게 유지됩니다. 본 연구에서 이 분석법을 통해 가해진 힘의 함수로서 MMP1의 촉매 효율을 측정할 수 있었습니다. 데이터를 분석한 결과, 콜라겐 삼중 나선이 단백질 분해 이전에 국소적으로 풀려야 한다는 것을 확인하였습니다.

이 기술을 숙달하면 정확하게 수행했을 때 5~6시간 내에 완료할 수 있습니다. 데이터의 통계적 유의성을 충분히 확보하기 위해서는 시야당 최소 30~50개의 비드가 필요하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. PMA는 매우 위험할 수 있으므로, 이 실험을 수행하는 동안에는 항상 장갑, 실험복, 안면 마스크와 같은 보호 장구를 착용해야 함을 잊지 마십시오.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 마그네틱 트위저(magnetic tweezers)를 사용하여 단일 단백질의 단백질 분해 절단에 가해지는 힘의 영향을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 마그네틱 트위저는 단일 분자 생물물리학 실험을 이해하는 데 매우 유용한 도구입니다. 이 기술은 다른 프로테아제 및 기질 조합으로도 확장하여 적용할 수 있습니다.

또한, 유사한 기술을 사용하여 단백질의 구조적 역학을 이해할 수 있을 뿐만 아니라, RNA 또는 DNA에 결합하거나 이를 변형하는 다른 단백질들을 이해하는 데에도 활용할 수 있습니다.