상수 강제 축 방향 광학 족집게로 DNA의 짧은 시퀀스를 스트레칭

이 절차의 전반적인 목표는 정밀하게 교정된 일정한 광학력을 이용하여 길이가 100 nanometers인 짧은 DNA 분자를 조작하는 것입니다. 이는 DNA의 한쪽 끝을 커버 슬립에, 다른 쪽 끝을 폴리스티렌 미세구체에 결합함으로써 수행됩니다. 그다음, 광학 집게(optical tweezers)를 정렬하고 교정합니다.

그 다음, 마이크로구슬에 작용하는 구배력(gradient forces)과 산란력(scattering forces)의 조합을 통해 DNA를 표면으로부터 늘려줍니다. 마지막으로, 비드를 퍼텐셜의 선형 영역에 트랩핑하여 DNA를 연장시킵니다. 이 프로토콜은 DNA의 기계적 특성과 DNA-단백질 결합 역학을 연구하는 데 사용되어 왔으며, 짧은 DNA 구조체의 탄성에서 경계 조건의 중요성을 규명하는 데에도 유용하였습니다.

일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 개인들은 정적 힘 광학 집게(constant force optical tweezers)의 정렬과 보정 과정이 어렵고 복잡하기 때문에 어려움을 겪게 됩니다. 광학 집게에는 1064 nanometer 레이저 빔이 포함되며, 이는 서로 직교하는 편광 빔 두 개로 분할됩니다. 하나는 생체 분자를 조작하는 데 사용되고, 다른 하나는 보정 목적으로 사용됩니다.

조작 빔의 강도는 AO 광학 편향기 또는 OD로 제어됩니다. 그 후 빔들은 다른 편광 빔 분할기를 통해 다시 결합됩니다. 빔들은 plan APO 60 x 1.4 오일 침수 현미경 대물렌즈에 의해 시료 셀 위로 정밀하게 집속됩니다. 이 트위저 설정은 콘덴서에 의해 시료 챔버로 집속되는 할로겐 램프 조명을 제공하는 자체 제작 명시야 현미경과 결합되어 있습니다.

명시야 이미지는 다이크로익 미러(dichroic mirror)에 의해 레이저 광과 분리된 후 두 대의 CCD 카메라에 이미지화됩니다. 하나의 CCD는 데이터 획득의 주된 수단으로 작동하며, 정확한 샘플링 속도를 구현하기 위해 소프트웨어적으로 트리거됩니다. 다른 CCD는 고정된 하나의 기준 미세구체를 이미지화하는 데 사용되며, 이 구체의 위치는 현미경의 표동(drift)을 보정하기 위한 피드백 제어 시스템의 역할을 합니다.

XY 스테이지를 이용하여 대물렌즈에 대해 샘플의 위치를 대략적으로 잡은 후, 내장된 3차원 piso 스테이지를 통해 정밀하게 위치를 조정할 수 있습니다. 비드 크기를 보정하기 위해 전방 산란광 및 투과 레이저광을 명시야 콘덴서로 수집하여 광검출기에 집중시킵니다. 인산염 완충 식염수에 희석된 직경 800 nanometer의 폴리스티렌 미세구체 분산액을 샘플 챔버에 로딩합니다. 10분에서 15분 동안 그대로 둔 다음, 버퍼로 가볍게 세척합니다.

과잉 마이크로스피어를 제거하기 위해, 커버 글라스에 무작위로 부착된 마이크로스피어를 찾고 마이크로스피어가 초점보다 약 1 µm 아래에 위치할 때까지 시료 챔버의 높이를 조정합니다. LabVIEW를 사용하여 이미지의 겉보기 크기를 측정하기 위한 디포커스(defocused) 이미지를 생성하려면, 먼저 기하학적 패턴 매칭 기능을 사용하여 마이크로스피어의 중심을 찾습니다. 그다음, 360도를 평균하여 마이크로스피어의 방사형 강도 프로파일을 생성합니다.

각 단면의 중심을 기준으로, 각 명시야 이미지에서 흰색 링에 해당하는 방사형 프로파일을 2차 함수로 피팅합니다. 밝기 피크를 찾고, 이 피크와 중심 사이의 거리를 보정된 pico 스테이지를 사용하여 비드의 겉보기 크기의 척도로 활용할 수 있습니다. 미세구체의 축 방향 위치를 점진적으로 증가시키며 각 위치에서 CCD 카메라로 이미지를 획득합니다. 각 연속 이미지에 대해 이미지 분석을 반복하여 미세구체의 겉보기 크기와 축 방향 위치 사이의 상관관계를 분석합니다.

이 방법을 통해 얻은 축 방향 분해능은 약 1.4 nanometers입니다. 조작 빔의 광학 포텐셜을 매핑하려면, 먼저 조작 빔을 끈 상태에서 조작 빔과 보정 빔을 공선 정렬하십시오. 보정 빔의 훨씬 더 강력한 트랩 내에 자유 마이크로구체를 가두십시오. 이제 조작 빔을 켭니다.

보정 빔보다 훨씬 약하기 때문에 마이크로구체의 축 방향 위치가 약간 변동될 것입니다. 결과적으로 발생하는 축 방향 위치의 변화는 이미 설명한 대로 디포커스 명시야(defocused bright field) 이미지에서 측정할 수 있습니다. 축 방향 초점을 이동시키고 이를 반복하여, 보정 빔 초점의 축 방향 위치에 따른 변위 delta X를 그래프로 나타내십시오.

마이크로구체의 변위가 가장 큰 지점에 해당하는 축 방향 위치가 광학 트랩 선형 영역의 중심을 결정합니다. DNA 샘플을 신장시키려면 표면에 결합된 DNA 분자가 포함된 챔버를 장착하고, 명시야 이미지를 관찰하면서 망원경을 조정하여 조작 빔의 초점을 신장되지 않은 마이크로구체보다 약간 위에 둡니다. 그 다음, 마이크로구체 중 하나가 트랩될 때까지 스테이지의 위치를 조정합니다. 마이크로구체를 광학 트랩 XY 평면의 중심에 대략적으로 위치시키고, LabVIEW에서 일련의 사각파를 생성하여 A OD로 보내 레이저 빔을 반복적으로 켜고 끕니다.

트랩을 반복적으로 켜고 끌 때 미세구(microsphere)를 관찰하십시오. 그리고 X 및 y 방향으로 미세구의 위치를 반복적으로 조정하면서 레이저가 미세구의 운동에 특정 선호 방향을 유도하는지 확인하십시오. 피조(piso) 스테이지를 제어하면 미세구의 무작위 운동은 X-y 평면에서 등방성(isotropic)이 되어야 하며, 레이저가 켜져 있을 때는 눈에 띄게 제한될 것입니다.

다음으로, Z 방향으로 비드를 정렬합니다. 다시 한번 레이저 빔을 단속적으로 조사합니다. 이때 마이크로구체의 축 방향 변위(axial displacement)를 실시간으로 동시에 측정합니다.

DNA 램프를 신장시켰을 때 Z 변위가 최대가 되는 지점인 선형 영역 내에 스테이지를 중심시키고, A OD에 0V에서 0.5V까지 0.025V 단계로 전압 신호를 보내 레이저 강도를 조절합니다. 초당 100프레임으로 400프레임을 기록하고 이를 평균하여 축 방향 변위를 구합니다. 마지막으로, 힘-신장 곡선을 그리고 이를 수정된 웜-라이크 체인(worm-like chain) 모델에 맞춥니다.

여기에 DNA의 짧은 구간인 1, 298 bp 및 247 bp 길이의 2D NA 서열에 대한 힘-신장 곡선(force extension curves)이 나타나 있습니다. 일반적인 웜라이크 체인(worm-like chain, WLC) 모델은 이러한 길이 규모에서 유한 크기 효과(finite size effects)와 경계 제약으로 인해 발생하는 제로 힘 신장(zero force extension)을 고려해야 하므로 힘-신장 관계를 완전히 설명하지 못합니다. 따라서 힘-신장 측정값은 수정된 WLC 모델을 사용하여 피팅해야 하며, 보충 자료에 자세히 설명된 바와 같이 유효 지속 길이(effective persistence length)와 제로 힘 신장을 피팅 파라미터로 사용합니다.

D-S-D-N-A의 윤곽 길이가 길 경우, 유효 지속 길이는 단순히 공칭 지속 길이인 약 50 nanometers이며, 수정된 WLC 피팅에서 제로 힘 신장(zero force extension)은 무시될 수 있습니다. 개발 후, 유효 지속 길이는 1, 298 base pair DNA의 경우 35 nanometers, 247 base pair DNA의 경우 25 nanometers로 나타났습니다. 이 방법은 조절 단백질 매개 DNA 루프의 형성 및 붕괴 역학 연구를 포함하여, DNA 및 DNA-단백질 복합체에 대한 다양한 나노 기계적 측정의 길을 열어주었습니다.