비장의 Intravital 현미경 : 기생충 이동성 및 혈류의 정량 분석

본 절차에서는 비장을 통과하는 기생충의 동태를 평가하기 위한 정량적 생체 내 현미경 분석 방법을 설명합니다. 설치류 말라리아 모델에서 GFP 형질전환 기생충에 감염된 마우스를 준비하여 비장의 생체 내 현미경 관찰을 수행하며, 비정맥 캐뉼라 삽입을 통해 생체 내 염색약을 주입합니다. 실험 과정 동안 비장의 서로 다른 영역에서 이동하는 형광 세포를 영상화합니다.

우리는 적색수의 3차원 저속 구획 내 기생충 이동성을 설명하는 방법론을 제공하고 혈관 혈류량을 계산합니다. 이 매개변수들은 두 PULE 계통의 비장 역학을 비교하는 데 사용되었습니다. 안녕하세요 여러분.

제 이름은 Nando El Portillo이며, 제 실험실의 주요 연구 과제 중 하나는 말라리아에서 비장의 역할을 이해하는 것입니다. 비종대(S splenomegaly)는 이 질병의 특징 중 하나이지만, 기술적 및 윤리적 문제로 인해 이 장기에 대한 연구를 수행하는 것은 매우 어렵습니다. 이를 위해 우리는 기생충의 역동적인 통과 과정을 관찰하고 이 현상을 정량화할 수 있는 기술을 도입하였습니다.

Lorena와 MI가 본 프로토콜에서 설명할 내용은 다음과 같습니다. 본 연구는 독일 함부르크 대학의 Dr.Ler 연구팀 및 이곳 hospital Clinic의 Dr.Maria Kbo 연구팀과의 협업으로 일부 진행되었으며, found fion Cellex 및 ministerial CIA의 일반 기금 지원을 받았습니다. 감염은 10% parasite 농도의 치사성 또는 비치사성 GFP parasites를 Donor M에 감염시켜 시작합니다. 기생충 감염 여부를 확인하려면 마우스 꼬리 정맥에서 소량의 혈액을 채취하여 현미경 슬라이드 위에 도말합니다.

GIMs를 이용한 혈액 도말 염색법입니다. 이 용액을 사용하면 건조 후 감염된 적혈구를 시각화할 수 있습니다. 혈액 도말 표본을 메탄올로 2분 동안 고정한 다음, GIMs 용액을 처리하고 20분 동안 배양합니다. 슬라이드를 흐르는 수돗물로 세척하고 건조합니다. 100배 오일 렌즈가 장착된 광학 현미경을 사용하여 전체 RBC 대비 pbc의 백분율을 산출합니다.

공여 마우스의 꼬리 혈액에서 얻어 PBS에 희석한 치사성 또는 비치사성 기생충을 마우스에 감염시킵니다. 감염 후 3일째에 말초 기생충 수치가 1%에 도달하도록 마우스당 50만 개의 기생충을 투여하며, 복강 내로 주입합니다. 또는 대조군으로 FITC 표지 RBC를 사용할 수 있습니다.

마우스로부터 1 mL의 동맥혈을 채취하고, EDTA가 포함된 PBS에서 원심분리하여 펠릿을 세척한 후 FITC 용액에 재현탁하여 약한 교반과 함께 암소에서 2시간 동안 배양합니다. 그 후, 원심분리로 상층액을 제거하고 충분히 세척합니다. 이를 대조군 마우스에 주입하여 말초 혈액 순환 내 평균 1%가 되도록 한 뒤 in vivo 실험을 진행합니다.

안녕하세요, mija입니다. 생체 내(in vivo)에서 비장을 촬영하려면, 비장을 노출시키기 위해 동물을 대상으로 간단한 수술을 수행해야 하며, 이는 매우 명확한 기술입니다. 저는 이 기술을 worker Heisler 연구실의 Stephanie GR로부터 배웠으며, 이에 대해 감사드립니다. 이제 그 진행 방법을 보여드리겠습니다.

감염된 생쥐의 이미징은 두 균주 모두에서 파라사이트(parasite) 함량이 1%인 감염 후 3일 차에 수행되었습니다. 절차 전반에 걸쳐 생쥐가 마취 상태를 유지하고 적정 온도가 조절되도록 합니다. 안구를 수분으로부터 보호하고, 물질의 정맥 내 투여를 용이하게 하기 위해 진행 전 발바닥 패드를 찔러 생쥐가 완전히 마취되었는지 확인하십시오.

실험 과정 동안, 캐뉼라를 설치하기 위해 마우스 꼬리 정맥에 캐뉼라를 삽입하십시오. 튜브의 한쪽 끝에 작은 바늘을 넣고 반대쪽 끝에 어플리케이터를 장착합니다. 기포를 제거하며 생리식염수로 캐뉼라를 채우고, 용액이 캐뉼라를 통해 제대로 흐르는지 확인하십시오.

꼬리의 측면 정맥에 캐뉼라를 삽입합니다. 꼬리 기저부를 가볍게 압박하여 정맥의 가시성을 높입니다. 캐뉼라의 끝단을 정맥 내부로 삽입합니다.

혈액이 나타나면 바늘이 적절한 위치에 삽입되었음을 의미합니다. 그렇지 않은 경우, 정맥의 상류 쪽에서 캐뉼라 삽입을 반복한 후, 접착제와 테이프를 사용하여 캐뉼라를 꼬리에 고정합니다. 동물의 왼쪽 등 쪽 피부와 근육층을 작게 절개하여 비장의 하단을 노출시킵니다.

호흡으로 인한 움직임이 적은 위치에 비장을 배치하고, 노출된 표면에 PBS를 도포하여 마우스 털을 제거하고 수분을 유지합니다. 가시성을 확보하기 위해 커버 슬립으로 비장을 밀봉합니다. 안녕하세요, 제 이름은 Lorena입니다.

제시된 프로토콜을 통해 비장 내 PULI 기생충의 이동을 시각화할 수 있습니다. 이는 GFP 형질전환 기생충을 통해 가능했으며, 해당 기생충은 드렉셀 대학교의 James Burnes가 기증하였습니다.

형광 표지된 기생충의 이동을 이미징함으로써 치사성 균주와 비치사성 균주 간의 행동 차이가 있는지 확인할 수 있습니다. 라이카(Leica) 다광자 현미경을 이용해 현미경 실험을 수행하였으며, 해당 현미경에는 온도 제어가 가능한 배양 시스템과 63 x 글리세롤 대물렌즈가 장착되어 있었습니다. 동물을 현미경 스테이지 위에 놓고 커버슬립을 덮은 뒤, 비장이 대물렌즈를 향하도록 아래쪽으로 배치하였습니다.

저배율에서 비장을 시각화하면 해당 장기의 미세 혈류 구조에 대한 전반적인 관찰이 가능합니다. 자가형광 조직을 이용하여 비장의 초점을 맞추면, GFP 표지 기생충이 비장의 서로 다른 영역을 통과하는 것을 관찰할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 바르셀로나 대학교 과학기술센터의 Maria Albo이며, 비장의 생체 내 영상 촬영을 진행하도록 하겠습니다.

감염된 적혈구의 혈류와 이동성을 연구하기 위해, 장기의 움직임으로 인한 영향을 방지하는 데 유용한 고속 이미징이 가능한 레조넌트 스캔(resonant scan) 장착 공초점 현미경을 사용합니다. 이는 가시 범위를 선택할 수 있는 스펙트럼 현미경입니다. 매우 빠른 이미징을 위해 두 가지 플루오레세인(fluorescein) 표지와 반사상을 동시에 획득하겠습니다.

RBC, 반사, 대비 및 Vidal 염색액을 사용하여 비장의 미세혈관 구조를 입증하기 위해 이미징할 서로 다른 구역을 선택합니다. 이제 Vidal 현미경과 Image J 소프트웨어를 사용하여 적색수의 3차원 망상 구조 내에서 기생충의 이동을 추적함으로써 혈관 혈류 내 기생충 이동성을 측정하는 방법을 설명하겠습니다. 고속 스캐닝 모드를 사용하여 5개의 Z-depth에서 이미지를 획득하십시오.

단일 형광 세포의 추적을 용이하게 하기 위해 이미지 스택을 Z-coded 컬러 동영상으로 변환하십시오. 비디오별로 X, Y, Z 및 T 좌표를 사용하여 시간에 따른 서로 다른 입자를 추적하는 세부 정보가 텍스트에 제공됩니다. 방향성, 평균 속도 및 체류 시간과 같은 이동성 파라미터를 계산하고 이를 분포 지도로 나타내어 균주 집단 간의 비교 분석이 가능합니다. 비장의 혈관 흐름은 덱스트린과 같이 보조 표에 설명된 여러 형광 분자를 전신 투여하여 이미징할 수 있습니다.

그리고 내인성 적혈구 반사 대조 스캔을 사용하여 혈관을 레이저 스캔 방향과 수평으로 배치하고 향상된 라인 평균(Line average) 설정을 통해 중심선 혈류를 스캔합니다. 이 이미지에서 이동하는 세포로 인해 발생하는 줄무늬를 이용하여 혈류를 계산하며, 변동을 보정하기 위해 서로 다른 직경의 혈관과 심장 주기 전반에 걸쳐 이미지를 촬영합니다. 비장은 오랫동안 말라리아 연구에서 블랙박스로 여겨져 왔으며, 본 연구에서는 이 장기 내의 기생충 감염 및 혈류 역학에 대한 통찰을 얻기 위해 정량적 생체 내 현미경 접근법을 개발하였으며, 이를 통해 감염된 적혈구의 비장 내 생체 내 부착과 같은 중요한 생물학적 질문들을 해결할 수 있었습니다.

감사합니다.