인플루엔자에의 DNA Microarray에 ampliPHOX Colorimetric 검색

다음 실험의 전반적인 목표는 새롭고 신속한 신호 증폭 방법을 활용하여 저밀도 마이크로어레이 플랫폼인 flu chip에서 인플루엔자 바이러스 아형을 검출하고 특성화하는 것입니다. 이는 biotinylated DTP를 통합하고 5' 말단에 인산기가 있는 프라이머를 사용하여 인플루엔자 RNA 추출물로부터 matrix 유전자 세그먼트와 non-structural 유전자 세그먼트를 증폭함으로써 달성됩니다. PCR 이후 효소 소화 및 단편화를 통해 짧은 단일 가닥의 biotinylated 증폭 바이러스 산물을 생성하며, 이를 어레이에 하이브리드화합니다.

Fox 검출법은 광중합을 이용해 하이브리드화가 일어나는 커다란 폴리머 스팟을 성장시키며, 서로 다른 하이브리드화 패턴을 통해 인플루엔자 바이러스 아형을 검출합니다. 표준 형광 검출과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 비용이 상당히 저렴하고, 형광 검출과 유사한 분석 감도를 가지면서도 육안으로 빠르게 결과를 확인할 수 있다는 점입니다. 또한, 이 방법은 보편적인 검출법이기 때문에 flu 칩을 사용하여 인플루엔자 바이러스의 특성 분석에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.

Ampl Fox는 다른 DNA 및 단백질 기반 저밀도 마이크로어레이와 같이 매우 다양한 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 이론적으로 모든 비오틴화 생성물은 amox를 사용하여 검출할 수 있어야 합니다. 이번 절차의 시연은 지난 몇 년 동안 Fox 기기 및 검출 화학 개발의 중심 역할을 해온 Endeavor의 부연구원인 Amber Taylor와 연구 보조원인 Kevin Moulton이 담당하겠습니다.

바이러스 RNA 추출 키트와 제조사의 프로토콜을 사용하여 200 µL의 바이러스 분리물에서 바이러스 RNA를 추출합니다. 최종 부피 60 µL로 용출하고, 추출물은 나중에 사용하기 위해 -70 °C 이하에서 보관합니다. 그다음 제조사의 프로토콜에 따라 얼음 위에서 RT-PCR 마스터 믹스를 준비합니다.

BIOTINYLATED DNTP 혼합물을 사용하여, 표시된 농도가 포함된 flu 칩 프라이머 믹스를 마스터 믹스에 추가합니다. 효소 소화를 촉진하기 위해 각 세트 중 하나의 프라이머는 5' 인산기를 포함해야 합니다. flu A 프라이머 세트는 1032 base pair 생성물을 생성하며, flu B 프라이머 세트는 811 base pair 생성물을 생성합니다.

마스터 믹스를 가볍게 볼텍싱한 후 18 µL씩 얇은 벽 PCR 튜브에 분주합니다. 그런 다음 각 반응 튜브에 2 µL의 RNA 템플릿을 첨가합니다. PCR 튜브를 서멀 사이클러로 옮기고 적절한 어닐링 온도가 설정된 사이클링 프로파일을 사용하여 반응시킵니다.

이 분석에 사용된 사이클링 프로필이 여기에 제시되어 있습니다. PCR 반응당 효소 반응 버퍼 2.2 microliters, nuclease free water 0.8 microliters 및 lambda exonuclease enzyme 1.0 microliters를 혼합하여 효소 소화 믹스를 준비하십시오. 써멀 사이클러에서 샘플을 꺼내 각 PCR 튜브에 4 microliters씩 추가하십시오.

시료를 써멀 사이클러에 다시 넣고, 써멀 사이클러를 표시된 대로 37 °C에서 15분, 이어서 95 °C에서 10분이 되도록 설정합니다. 다음으로, 하이브리드화할 마이크로어레이 주변에 일회용 하이브리드화 웰을 배치합니다. 그런 다음 오비탈 쉐이커 위에서 110 mL의 정제수로 슬라이드를 5분 동안 세척합니다.

웰의 가장자리에 티슈 와이프를 살짝 접촉시켜 슬라이드를 건조합니다. 2x 하이브리드화 버퍼 22 µL를 각각의 단편화된 단일 가닥 DNA 생성물과 혼합하여 짧게 섞은 후, 40 µL를 마이크로어레이 웰에 피펫팅합니다. 습도 챔버 내에서 1시간 동안 슬라이드를 하이브리드화합니다. 하이브리드화가 완료되면 슬라이드를 습도 챔버에서 꺼내어 각 슬라이드를 세척 버퍼 D 2 mL로 짧게 헹굽니다. 슬라이드를 슬라이드 랙에 넣습니다.

다음으로, 오비탈 셰이커를 사용하여 각각의 용기에 세척 버퍼 A와 B를 110 milliliters씩 넣습니다. 이후 모든 세척 단계에서 사용될 속도인 60 to 90 RPM으로 슬라이드 랙을 버퍼 A에서 1분 동안 세척합니다. 그 다음 슬라이드 랙을 세척 버퍼 A에서 꺼내어 세척 버퍼 D로 짧게 헹굽니다. 슬라이드 랙을 세척 버퍼 B로 옮기고 오비탈 셰이커에서 5분 동안 세척합니다.

세척 후, 각 슬라이드 위의 어레이를 티슈 와이프로 부드럽게 건조시키고 건조된 슬라이드를 습도 챔버에 넣습니다. Fox 컬러 메트릭 검출 단계를 준비하기 위해, 처리할 각 어레이당 amplitude 10 µL, 2x amplitude 버퍼 20 µL, 정제수 10 µL를 혼합합니다. 라벨 혼합물 40 µL를 각 어레이에 옮기고 밀폐된 습도 챔버에서 5분 동안 라벨링 반응이 진행되도록 합니다. 하이브리드화가 진행되는 동안, 용기에 세척 버퍼 C 110 mL를 준비합니다. 라벨링 후, 각 어레이를 세척 버퍼 D로 즉시 헹굽니다. 각 슬라이드를 슬라이드 랙에 넣고 오비탈 셰이커에서 세척 버퍼 C로 5분 동안 세척합니다. 버퍼 C 세척 후, 슬라이드 랙을 정제수가 담긴 용기에 세 번 빠르게 담갔다 뺍니다.

염분 잔여물을 제거하기 위해 이전 단계에서 설명한 대로 어레이를 건조합니다. 광활성화 및 이미징이 완료될 때까지 어레이를 어두운 슬라이드 보관함에 보관하며, 이 과정은 24시간 이내에 완료해야 합니다. 다음으로, Amli Fox 리더를 켜고 어레이 샘플 검출 전 광활성화를 위해 Amli view 소프트웨어가 준비되었는지 확인합니다.

먼저, 짧은 캘리브레이션 절차에 따라 모든 샘플에 대한 최적의 광활성화 시간을 결정합니다. 매일 사용 전 한 번, Amplify 솔루션을 실온으로 데운 후 짧게 볼텍싱하여 혼합하고, Amplify 인핸서 3 µL를 Amplify 바이알에 피펫으로 넣고 충분히 볼텍싱합니다. 10초 동안 한 번에 하나의 슬라이드에만 Amplify 솔루션 40 µL를 기포가 생기지 않도록 고르게 도포합니다.

마이크로어레이 슬라이드를 Amplify Reader의 광활성화 베이(photo activation bay)에 삽입하십시오. 캘리브레이션 과정에서 결정된 광활성화 시간을 사용하여 PL view 소프트웨어에서 'start'를 선택하여 광활성화를 시작하십시오. 완료되면, 과량의 amplify clear 폴리머를 제거하기 위해 마이크로어레이를 2 mL의 정제수로 헹굽니다. 이제 표적 DNA가 포함된 스팟에서 폴리머 형성이 일어났으며, 이를 통해 시각화가 더욱 용이해집니다.

염색 후, 폴리머 스팟을 2분 동안 건조시킵니다. 그다음 Amply Red 두 방울을 어레이에 떨어뜨리고 2분 동안 염색을 진행합니다. 염색 후 슬라이드를 정제수로 빠르게 헹구고 앞서 설명한 방법으로 건조시킨 뒤, 슬라이드를 Amli Fox 리더의 이미징 베이에 삽입하고 Amli 소프트웨어를 사용하여 이미지를 수집하고 결과를 처리합니다. 왼쪽 이미지는 Amli Fox를 통해 검출한 2009년 신종 H1N1 표본을 보여줍니다.

오른쪽 이미지는 공초점 형광 마이크로어레이 스캐너로 생성된 전통적인 형광을 사용한 것이지만, 두 방법 모두에서 동일한 전체 검출 패턴을 쉽게 확인할 수 있습니다. 하지만 Amli fox 결과는 육안으로 확인 가능합니다. 이 이미지들은 인간 유래 H3N2, 인간 유래 H1N1, 돼지 유래 H1N1 및 인플루엔자가 검출되지 않은 음성 fox 어레이의 flu 칩 결과를 보여줍니다.

파란색으로 표시된 서열 2와 3은 표시된 모든 인플루엔자 아형에 대해 신호를 생성합니다. 반면, 오른쪽 하단의 빨간색으로 표시된 서열은 돼지 유래 H1N1 검체에 대해서만 신호를 생성합니다. 음성 검체는 초록색으로 표시된 내부 대조군 서열에서 신호를 보여, RT-PCR 반응의 억제나 실패가 없었음을 나타냅니다.

전체 과정을 숙달하면 바이알 추출부터 amox 검출 및 최종 결과 해석까지 약 6시간 만에 수행할 수 있습니다. 기기 보정을 포함한 Ampl Fox 검출 단계는 본 절차를 따르면 약 30분 내에 완료될 수 있습니다. 추가적인 의문을 해결하기 위해 부분 또는 전체 게놈 시퀀싱과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

이 인플루엔자 분석법은 특히 고유한 하이브리드화 패턴이 나타나는 샘플에 대한 초기 스크리닝 용도로 설계되었습니다. 본 검출법은 일반적인 분석법이므로, 연구자들이 검출 효율을 통해 가치를 더할 수 있는 새롭고 흥미로운 저밀도 마이크로어레이 응용 분야를 찾을 수 있기를 바랍니다.