ASC의 분화를 제어하는​​ Bilayered 히드로겔 꾸민

이 절차의 전반적인 목표는 상처 치유를 돕기 위해 줄기세포를 전달하고 분화시킬 수 있는 천연 생체 재료 기반의 복합 매트릭스를 제작하는 것입니다. 이는 먼저 실험 동물로부터 지방 유래 줄기세포(ASC)를 분리함으로써 이루어집니다. 그다음, 분리된 ASC를 미리 제작된 키토산 마이크로스피어에 로딩합니다.

그 다음, 섬유화된(FIBRILLATED) 콜라겐 겔을 캐스팅하고, A-S-C-C-S-M 비즈를 콜라겐 겔 위에 층층이 쌓습니다. 마지막으로, A-S-C-C-S-M 콜라겐 겔 위에 PEG 피브린 겔을 캐스팅하고 배지를 첨가합니다. 최종적으로, CSM 비즈로부터 콜라겐 및 PEG 피브린 매트릭스 양방향으로 A SC가 동시에 이동하는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 절차를 통해 단일 줄기세포 공급원이 콜라겐과 PEG 피브린 미세환경으로부터 서로 다른 신호를 받아, 다양한 인자를 생성하고 전혈관 구조 네트워크를 형성하도록 차별적으로 자극될 수 있습니다. 단일 재료 복합체나 탈세포화 피부 대체제와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 다른 제품들은 숙주에 의한 제품의 재혈관화를 능동적으로 해결하지 못한다는 점입니다. 저희는 분리된 RAD A SE가 돼지 피브린 매트릭스에서 배양될 때 혈관 표현형으로 분화하는 경향이 있다는 점을 발견했을 때 처음으로 이 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다.

이러한 관찰은 서로 다른 바이오 소재로 구성된 시스템에서 단일 줄기세포원을 동시에 활용할 수 있다는 개념으로 이어졌습니다. 지방 유래 줄기세포(ASC)를 분리 및 배양하고, 키토산 미세구체(CSM)를 준비하여 ASC를 CSM에 로딩한 후, succinyl glut derate 변형 peg를 4 mL의 tris 완충 식염수에 용해하여 폴리에틸렌 글리콜 피브린 하이드로젤을 준비합니다. 실험 직전에 0.22 µm 필터를 사용하여 용액을 멸균합니다.

6-웰 플레이트의 배양 웰에 500 µL의 피브리노겐 스톡과 250 µL의 PEG 스톡을 혼합하고, 37 °C의 5% CO₂ 가습 배양기에서 20분 동안 배양합니다. 그다음, 미리 준비한 250 µL의 A-S-C-C-S-M을 페길화된 피브리노겐 용액과 혼합한 뒤, 즉시 1 mL의 트롬빈 스톡 용액을 첨가하고 피펫을 사용하여 빠르게 한두 번 트리트레이션(trirate)합니다. 세포-겔 혼합물을 즉시 12-웰 플레이트에 옮기고 37 °C의 5% CO₂ 가습 챔버에서 10분 동안 배양합니다. 이어서, 생성된 PEG 피브린을 HBSS로 두 번 세척하고, 10% FBS가 첨가된 alpha minimal essential medium과 함께 37 °C의 5% CO₂ 가습 배양기에서 11일 동안 표준 광학 현미경 기술을 사용하여 배양합니다.

CSM에서 젤 혼합물로의 세포 이동을 관찰합니다. 2N 수산화나트륨을 사용하여 쥐 꼬리 힘줄에서 추출한 1형 콜라겐이 포함된 A-S-C-C-S-M을 준비합니다. pH를 6.8로 조정하고 섬유화시킵니다. 섬유화된 콜라겐 A-S-C-C-S-M 혼합물을 12-웰 플레이트에 넣고 37°C, 5% CO₂ 가 가습된 배양기에서 30분 동안 배양합니다.

섬유화가 완료되었는지 확인한 후, collagen A-S-C-C-S-M 겔을 37°C의 5% 이산화탄소 가습 배양기에서 최대 11일 동안 배양합니다. 표준 현미경 기술을 사용하여 11일 동안 CSM에서 겔 내부로의 세포 이동을 관찰함으로써, 두 개의 바이오 스캐폴드를 이용해 단일 줄기세포원의 이동 및 공동 유도 특성을 연구하기 위한 이층 구조체를 제작합니다.

콜라겐과 PEG 피브린 겔을 각각 준비하되, 다음과 같이 약간의 수정 사항을 적용합니다. 먼저 7.5 mg/mL 농도의 콜라겐 1 mL를 준비합니다. 그런 다음 혼합물을 6-well 조직 배양 인서트(tissue culture insert)로 옮기고 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 섬유화가 완전히 완료되면, 콜라겐 표면에 배양액에 포함된 5 mg의 A-S-C-C-S-M 200 µL를 얹어줍니다.

마이크로스피어가 겔 위에 가라앉은 후, 250 µL의 세포 배양 배지를 사용하여 PEG 피브린 겔을 준비합니다. 그다음, 페길화된 피브리노겐 트롬빈 용액을 A-S-C-C-S-M 콜라겐 층 위에 층층이 쌓습니다. 완료되면, 완전한 중합을 위해 5% carbon dioxide 가습 배양기에서 구조물을 30분 동안 배양합니다.

마지막으로, 구조물 위의 상단 챔버에 배지 1 mL를 넣고 하단 챔버에 배지 3 mL를 넣습니다. 이 스캐폴드 내에 매립된 SC의 특성 분석 결과, CSM이 적재된 SC는 콜라겐 층과 peg 피브린 층 사이에 샌드위치 형태로 배치될 수 있으며, 두 가지 세포외 환경 모두로부터 동시에 그리고 차별적으로 신호를 받아 새로운 조건에서 성장할 수 있음을 확인하였습니다. 여기서 보는 바와 같이, collagen은 ASC가 줄기세포 상태를 유지하는 능력을 지원하였으며, 이는 녹색으로 표시된 stro one의 발현과 섬유아세포 유사 형태를 통해 입증되었습니다.

반면, PEG 피브린은 ASC가 무혈관 표현형으로 분화하도록 유도했으며, 이는 여기에서 보이는 것처럼 루멘(lumen)을 갖춘 관 모양의 형태와 빨간색으로 표시된 내피세포 특이적 von Willebrand 인자 발현을 통해 입증됩니다. 또한, 여기서 보여주듯이 이러한 관찰된 표현형은 배양 초기에 나타나 11일 동안 유지되었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 쥐의 지방 유래 줄기세포를 분리하고, 이를 키토산 마이크로스피어에 로딩하며, FDA 승인 생체 재료를 사용하여 이중층 하이드로젤에 통합하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

본 프로토콜에 사용되는 생체 재료와 세포는 동물 및 인간 유래이며, 호스트의 병원균에 오염되었을 경우 매우 위험할 수 있음을 유의하십시오. 따라서 이러한 절차를 수행하는 동안에는 개인 보호 장구 착용 및 무균 세포 배양 기술과 같은 예방 조치를 항상 취해야 합니다.