Tali 이미지 기반 Cytometer를 사용하여 GFP의 표현과 생존 능력의 평가

본 영상은 tally 이미지 기반 사이토미터를 사용하여 GFP를 발현하는 세포의 세포 생존율을 결정하는 절차를 보여줍니다. GFP가 형질전환된 세포는 tally viability kit dead cell red를 사용하여 염색하며, 이는 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide)를 통해 모든 사멸 세포를 붉은색으로 염색합니다. 이후 세포를 tally 세포 분석 슬라이드에 피펫팅하여 사이토미터에 로딩하면, 장비가 명시야(brightfield) 및 적색 및 녹색 형광 이미지를 획득하고 분석합니다. 그런 다음 전통적인 유세포 분석법(flow cytometry)과 비교하여 세포 수, 세포 크기, PI 형광 강도 및 GFP 형광 강도를 표시하는 히스토그램을 생성합니다.

Tali는 세포 생존율 및 발현에 관한 유사한 데이터를 제공할 수 있습니다. 하지만, 이 이미지 기반 사이토메트리는 분석 중인 세포 집단에 대한 추가적인 시각적 정보를 제공합니다. 유세포 분석이나 형광 현미경과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, tally 이미지 기반 사이토메터가 세포 샘플에 대한 정량적 정보와 시각적 정보를 동시에 제공한다는 점입니다.

또한, tally 장비는 유세포 분석기나 형광 현미경보다 사용하기 쉽고 비용이 저렴하며 공간을 덜 차지합니다. 이를 통해 연구자들은 벤치탑에서 GFP 발현 세포의 생존율과 같은 정량 분석을 신속하게 수행할 수 있습니다. 본 절차에서는 1 × 10⁶ cells/mL 농도의 U2 OS 세포에 핵 타겟팅 cell light GFP 바이러스 컨스트럭트를 도입하고, 사멸 세포를 염색하기 위해 propidium iodide를 처리한 후, 세포 현탁액 100 µL를 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮겼습니다.

분석을 위해 mL당 1 × 10⁵에서 1 × 10⁷ cells의 농도가 권장되지만, 농도가 정확할 필요는 없습니다. 다음으로, tally dead cell red 시약을 1 µL 첨가합니다. 그런 다음 짧게 볼텍싱하여 섞어준 뒤, 염색 시약과 세포 혼합물을 실온의 암소에서 1~5분 동안 배양합니다.

배양 후, 즉시 tally 이미지 기반 세포 분석기로 분석을 진행하십시오. tally는 해당 기기 전용으로 설계된 일회용 플라스틱 세포 분석 슬라이드를 사용합니다. 슬라이드를 로드할 때는 항상 슬라이드의 가장자리를 잡으십시오.

샘플 25 µL를 반달 모양의 샘플 로딩 영역 중 하나에 천천히 피펫팅합니다. 여기에서 염색되지 않은 비형질도입 대조군 세포는 챔버 A에, 염색된 GFP 발현 세포는 챔버 B에 로딩합니다. GFP 발현 세포의 생존능 분석을 수행하려면 사이토미터의 홈 화면에서 G-F-P-R-F-P를 터치하십시오. 그러면 오른쪽에 분석 옵션이 나타나며, 여기서 GFP plus viability를 선택합니다.

그런 다음 기기에서 샘플 시리즈의 이름을 지정할 것인지 묻는 메시지가 나타납니다. 'name now'를 누르십시오. 이어서 터치스크린을 사용하여 샘플 시리즈의 이름을 입력하고 'save'를 누르면 tally cytometer가 측정 화면으로 자동으로 넘어갑니다.

다음으로, 배경 형광을 측정하려면 여기 보이는 것처럼 측정 화면의 오른쪽 하단에 있는 background 탭을 누르십시오. 기본 설정은 9개의 세포 영역을 촬영하도록 되어 있습니다. 이제 대조군 샘플이 장치 반대 방향을 향하게 하여, 슬라이드가 멈출 때까지 로딩 포트에 삽입하십시오.

새로운 무염색 세포 대조군을 삽입하기 위해 배경 화면의 터치 버튼을 강하게 누르지 마십시오. 슬라이드는 자동으로 기기 내부로 끌어당겨지며, 세포의 실시간 이미지가 화면에 표시됩니다. 초점 조절 다이얼을 사용하여 초점을 맞추는 동안 세포를 적절한 시야 평면에 맞추십시오.

빨간색 확대 버튼을 4x 또는 16x로 슬라이드하십시오. 세포군을 더 잘 관찰하려면, 각 세포 주변에 밝은 헤일로가 있으며 세포 자체는 균일하게 어둡게 보여야 합니다. 여기에서 보는 바와 같이, 배경과 세포 가장자리 사이의 경계가 모호하여 세포 경계가 명확하게 정의되지 않을 경우 세포 수가 실제보다 적게 계산될 수 있습니다.

세포의 중심부가 밝고 주변부가 어두운 경우 세포 수가 과다하게 계수될 수 있습니다. 세포의 초점이 맞춰지면, touch를 누른 후 press를 눌러 무염색 세포 대조군(unstained cell control)을 실행하십시오. 배경 형광을 측정하기 위해 사이토미터가 자동으로 이미지를 캡처하고 각 시야의 썸네일을 표시합니다.

진행 표시줄을 통해 분석 상태가 실시간으로 업데이트됩니다. 이미지 캡처가 완료되면 사이토미터가 자동으로 슬라이드를 배출하고 캡처된 이미지의 분석 데이터를 제공합니다. 저장된 데이터는 background 탭의 드롭다운 메뉴에 표시됩니다.

배경 대조군 샘플에는 실험과 동일한 이름을 지정합니다. PI 염색된 GFP 형질도입 샘플을 실행하려면, 기기에서 슬라이드를 꺼내어 반대로 뒤집은 후 형질도입 샘플이 기기 반대 방향을 향하도록 다시 삽입하십시오. 샘플 탭을 누른 다음 'Press'를 터치하여 새 샘플을 삽입합니다.

화면에 이미지가 나타나면 초점 조절 노브를 사용하여 세포의 초점을 맞춥니다. 이전과 마찬가지로 샘플 실행(run sample) 버튼을 누릅니다. 이미지 캡처가 완료되면 분석 데이터가 샘플 탭에 표시되며, 세포 분석기는 슬라이드를 자동으로 배출합니다.

tally 세포 분석 슬라이드를 폐기하십시오. 해당 슬라이드는 생물학적 위험 폐기물이므로 재사용할 수 없습니다. 샘플 분석이 완료되면, 샘플에 임계값을 적용할 수 있습니다.

여기서 특정 세포군을 분석하기 위해, 생존 세포와 사멸 세포의 비율을 결정하도록 임계값을 조정하겠습니다. 샘플 탭의 GFP 발현 세포 항목에서, GFP를 발현하는 생존 세포의 수와 비율, GFP를 발현하는 사멸 세포, 그리고 전체 생존력이 표시됩니다. 평균 세포 크기, 계수된 세포 수 및 세포 농도가 함께 표시됩니다.

또한, 화면 하단에는 세포 크기, 녹색 형광 및 적색 형광을 나타내는 히스토그램 플롯이 표시됩니다. 세포 크기 게이트를 설정하려면 세포 크기 썸네일을 터치하여 세포 크기 히스토그램을 열고 모든 부스러기(debris)를 제외하십시오. 파란색 슬라이더 바를 이동시켜 크기가 너무 크거나 작은 이벤트들을 모두 제외하십시오.

게이트 내에 세포가 포함되도록 터치하십시오. 다음으로 분석에 GFP 형광을 추가하려면, GFP 히스토그램 썸네일을 터치하여 여십시오.

파란색 슬라이더 바를 이동하여 가장 낮은 피크의 바로 오른쪽에 임계값을 설정하십시오. 대조군 샘플을 가이드로 사용하십시오. 이렇게 하면 GFP 양성 세포는 분석에 포함시키고, 자가 형광 세포는 제외할 수 있습니다.

세포 내 생물학적 분자들이 여기될 때 자가형광이 빈번하게 관찰됩니다. 이를 확인하고 이전 화면으로 돌아가려면 터치하십시오. 이제 샘플 탭 아래에 표시되는 데이터는 두 형광 채널에 대해 설정된 게이트와 임계값을 반영해야 합니다. 다음으로, PI 염색 세포를 자가형광 또는 샘플에 존재하는 배경 신호로부터 분리하려면, PI 히스토그램 썸네일을 눌러 다시 엽니다.

대조군 시료 피크는 히스토그램에서 회색 피크로 표시됩니다. 빨간색 피크는 시료의 형광을 나타냅니다. 배경 형광은 이 장비에서 0 RFU 값에 가장 가까운 피크로 표시됩니다.

PI 채널의 배경 형광을 제거하려면 파란색 슬라이더 바를 이동하여 임계값을 조정하십시오. 이 피크를 제외하려면 대조군 샘플의 회색 피크를 기준으로 사용하십시오. PI 채널의 임계값이 적절하게 설정되면 '적용(apply)'을 터치하여 확인하고 이전 화면으로 돌아가십시오. 그러면 계수 장치가 데이터를 다시 자동으로 분석하여 샘플 탭의 결과를 업데이트합니다.

다음으로, 각 세포가 적절하게 지정되었는지 시각적으로 확인하려면 확대 탭을 누른 후, 이미지의 썸네일을 눌러 검토할 캡처 시야를 선택하십시오. 그런 다음 레이어 탭을 누릅니다. 이어서 GFP 또는 PI 버튼을 눌러 해당 채널을 통해 캡처된 이미지를 표시하십시오.

동일한 버튼을 다시 누르면 디스플레이에서 레이어를 제거할 수 있으며, 각 채널에 해당하는 버튼을 터치하여 특정 채널을 통해 세포가 어떻게 계수되는지 확인할 수 있습니다. 명시야 채널을 통해서만 계수된 세포, 즉 형광을 발현하지 않는 세포는 파란색 원으로 표시됩니다. 이는 해당 특정 세포가 녹색 채널에서 발현되는 살아있는 세포임을 나타냅니다.

빨간색 채널에서 발현되는 GFP는 녹색 세포로 원 표시될 것입니다. PI로 염색된 세포는 빨간색으로 원 표시되며, 이는 양쪽 모두에서 계산되는 죽은 세포입니다. 빨간색과 녹색 채널이 모두 나타나는 세포는 노란색으로 원 표시될 것입니다.

이는 세포가 GFP를 발현하고 있지만 pi로도 염색되었으며, 따라서 사멸했음을 나타냅니다. 때때로 화면에 검은색 원이 나타날 수 있습니다. 이는 식별되었으나 세포 크기를 기준으로 분석에서 제외된 객체들입니다.

각 형광 발현 세포가 적절한 색상으로 원형 표시될 때까지 앞서 설명한 단계에 따라 형광 히스토그램의 임계값을 계속 미세 조정하십시오. 모든 분석 파라미터는 데이터 탭의 기기에 자동으로 저장됩니다.

집계표에는 500회의 샘플 실행 데이터 파일이 저장될 수 있습니다. 데이터 탭에 저장된 각 파일은 재분석이 가능합니다. 데이터 탭에서 파일을 선택하면 파일이 다시 열리며, 모든 히스토그램과 레이어가 활성화되어 데이터를 아카이브하고 보고서를 생성할 수 있습니다.

기기에 저장된 데이터는 USB 드라이브를 사용하여 컴퓨터로 전송할 수 있습니다. 네 가지 대표적인 세포 유형에 핵 표적 세포 광원인 GFP 바이러스 컨스트럭트를 도입하고, dead cell red 시약을 이용한 tally viability kit로 염색한 후, 여기에서 보여주는 것처럼 유세포 분석기(flow cytometer)의 tally 기능을 통해 분석하였습니다. 두 방법 모두 각 세포 유형에서 GFP를 발현하는 세포군의 비율과, 생존하며 동시에 GFP를 발현하는 전체 세포군의 비율이 거의 동일하게 보고되었습니다.

이 데이터는 Tali 세포 분석기가 세포군 전체의 GFP 발현과 살아있는 세포군에서의 GFP 발현을 구분할 수 있음을 보여줍니다. 지금까지 Tali 이미지 기반 세포 분석기를 사용하여 세포 샘플의 형광 발현과 생존력을 평가하는 방법을 살펴보았습니다. 이 기술은 개별 세포 연구와 세포군 연구 사이의 간극을 메워줍니다.

tally 이미지 기반 사이토미터를 사용하여 개별 세포뿐만 아니라 더 큰 세포 집단에 대한 정량적 및 정성적 시각 정보를 수집할 수 있습니다. 동일한 절차를 통해 세포 사멸, RFP 발현 및 세포 생존능을 포함한 여러 다른 분석을 수행할 수 있습니다. 발현되지 않은 세포의 경우, 잠재적인 응용 분야에는 유전자 발현 평가부터 약물 효능 연구까지 포함됩니다.