신장 세포 Overexpressing 단백질 키나제 C Isozymes에 Mitochondrial 기능 및 세포 생존 능력의 평가

본 실험에서는 protein kinase C ISO xms의 선택적 조절을 통해 다양한 생리적 및 병리적 조건 하에서 신장 근위세뇨관 세포의 미토콘드리아 및 세포 기능을 결정합니다. 먼저, 신장 피질에서 일차 신장 근위세뇨관 세포를 분리하거나, 신장 근위세뇨관과 유사한 산화적 대사 능력을 갖춘 RPCs를 분리합니다.

RPCs에 활성 및 비활성 형태의 protein kinase C isozyme을 발현하는 아데노바이러스 벡터를 감염시킵니다. 그 후 다양한 미토콘드리아 기능과 세포 생존력을 분석하여, 해당 isozyme이 ATP 합성 능력 및 세포 사멸 방지에 미치는 영향을 결정합니다. 또한, 함께 채취한 세포 용해물에서 phosphorylated protein kinase C epsilon에 대한 면역 블롯 분석을 수행합니다.

결과에 따르면 protein kinase epsilon의 활성화는 ATP를 생성하는 미토콘드리아의 능력을 부정적으로 조절하여, 세포 내 ATP 수준과 신장 근위 세뇨관 세포의 생존율을 감소시킵니다. 세포주와 같은 기존 기술과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 신장 근위 세뇨관 세포의 일차 배양이 신장 근위 세뇨관의 분화 기능과 산화 상태를 유지한다는 점입니다. protein kinase는 표적 및 잠재적 치료제로 사용될 수 있으므로, 이 기술의 응용 범위는 신장 손상 예방 또는 손상 후 신장 회복 촉진을 위한 치료법까지 확장될 수 있습니다.

이 방법은 손상 및 회복 기전을 통찰하는 데 활용될 수 있습니다. 또한, 갓 분리한 토끼 신장의 피질을 수확하기 위해 50 mL의 멸균 D-M-E-M-F 12 배지와 멸균 인산염 완충 식염수(pH 7.4), 그리고 PBS 산화철 용액을 순차적으로 적용하는 등의 방식에 이용될 수 있습니다.

먼저 15 milliliter 다운 호모게나이저를 사용하여 조직을 균질화합니다. 그런 다음 균질액을 두 개의 멸균 메쉬 체에 걸러 1 liter 멸균 비커에 담습니다. 체에 남아 있는 세포를 deferoxamine 함유 버퍼로 헹굽니다.

85 micron sieve 바닥에 남은 조직을 원추형 원심분리관에 담긴 40 milliliters의 deferoxamine 함유 완충액으로 옮깁니다. 강한 자석을 사용하여 세포 현탁액을 부드럽게 혼합합니다.

철이 충진된 사구체를 포집하고 자석에 부착된 철을 흡인합니다. 세포 현탁액의 부피를 40 milliliters로 조절하고 collagenase가 포함된 소화 배지 1 milliliter를 첨가합니다. 상온에서 17분 동안 배양합니다.

현탁액을 부드럽게 혼합합니다. 여러 번 세척한 후, 4°C에서 50 ×g로 2분간 원심분리하여 세포를 회수합니다. 세포 펠릿을 포도당이 포함되지 않은 배지 46 mL에 다시 현탁합니다.

1mg/dish의 단백질 밀도로, 2mL의 포도당이 없는 D-M-E-M-F 12 배지를 사용하여 37°C, 5% carbon dioxide 조건의 오비탈 쉐이커에서 일차 RT PC를 배양합니다. 배지를 교체한 후, 합쳐진(confluent) RPT 세포에 constitutively active protein kinase C epsilon 또는 dominant negative protein kinase C epsilon을 운반하는 아데노바이러스 CD NA를 감염시킵니다. 24시간 동안 인큐베이션하고 배지를 교체한 뒤, 형질전환된 일차 RPC를 24시간 더 배양합니다. 일차 세포 단일층의 미토콘드리아 형태를 시각화하기 위해 배지를 교체하고 MIT tracker red 580을 첨가한 후, 배양 접시를 인큐베이터에 넣고 30분 동안 유지합니다.

그런 다음 수침 렌즈를 사용하여 형광 현미경으로 살아있는 단층 세포를 관찰합니다. 두 번째 목적은 미토콘드리아 기능을 평가하는 것이며, Clark 타입 전극이 장착된 산소 소비 챔버에서 RPTC 현탁액의 상태 3 호흡을 평가합니다.

먼저 DP가 없는 상태에서 상태 2 호흡을 측정합니다. 그다음 DP를 최종 농도 0.4 millimolar가 되도록 첨가합니다. 상태 3 호흡을 시작한 후, 상태 4 호흡을 위해 oligomycin을 최종 농도 0.5 micrograms per milliliter가 되도록 첨가합니다.

또한, state three에서 호흡 중인 세포에 0.5 µM FCCP를 첨가하여 비결합 호흡(uncoupled respiration) 측정값을 포함하십시오. 각 RPTC 배양 접시에 0.5 mM JC-1 용액 20 µL를 천천히 첨가하고 소용돌이치듯 흔들어 염료를 충분히 혼합합니다. 접시를 인큐베이터로 옮겨 30분 동안 배양합니다.

다음으로, 배양물을 얼음에 두고 차가운 PBS로 두 번 세척합니다. 그 후 세포를 회수합니다. RPT 세포를 에펜도르프 튜브로 옮기고 피펫팅을 통해 단층 세포를 단일 세포 현탁액으로 분리합니다.

488 nanometer 아르곤 이온 레이저 여기를 이용한 유세포 분석법으로 형광을 분석합니다. 그 다음, 분리된 미토콘드리아의 미토콘드리아 막 전위를 계산합니다. 이를 통해 호흡쇄의 무결성 평가를 용이하게 합니다.

얼음처럼 차가운 PBS 버퍼로 RPTC 단층을 두 번 세척한 후, 세포를 수확하고 원심분리를 통해 펠릿을 형성합니다. 펠릿을 1 mL의 버퍼 A로 한 번 세척한 다음, 현미경으로 관찰했을 때 균질액 내의 대부분의 세포가 파괴될 때까지 다운즈 균질기(Down's homogenizer)로 세포를 균질화합니다. 그다음, 저속 원심분리를 통해 세포 잔해를 제거합니다.

상층액으로부터 조분리된 미토콘드리아를 4°C에서 15,000 ×g로 10분간 원심분리하여 펠렛화하고, 펠렛화된 미토콘드리아를 버퍼 c로 3회 세척합니다. 미토콘드리아 펠렛을 50~100 µL의 분석 버퍼에 재부유시킨 후 액체 질소에 동결하여 NADH ubiquinone oxidoreductase 활성을 분석합니다. 분석 버퍼 500 µL와 첨가물 및 미토콘드리아를 추가합니다. 이때 모든 첨가물은 포함하되 미토콘드리아만 제외한 공시료(blank sample)도 함께 포함합니다. 플레이트를 30°C에서 5분간 혼합하며 평형화합니다.

다음으로, 플레이트를 분광광도계에 넣고 각 웰에 3.25 millimolar ubiquinone 10 microliters를 첨가하여 반응을 시작합니다. 22초 간격으로 3분 동안 340 nanometers에서 흡광도를 기록합니다. 유사한 분석법으로, ATP 합성효소 반응의 기질인 환원된 cytochrome C를 사용하여 cytochrome C oxidase의 활성을 측정합니다.

각 처리군의 총 APA 활성과 올리고마이신 불감성(oligo mycin insensitive) APA 활성을 분석하기 위한 혼합물을 준비합니다. 반응 혼합물이 담긴 샘플을 31 °C에서 10분 동안 배양합니다. TP 기질을 첨가하여 반응을 시작하고 31 °C에서 5분 동안 배양합니다.

배양 혼합물 200 µL를 3 M TCA 50 µL가 들어 있는 튜브로 옮기고, 얼음 위에서 10분간 단백질을 침전시킵니다. 그 다음 원심분리를 통해 펠렛을 형성합니다. 이어서 96-웰 플레이트에 각 인산 표준물질 50 µL와 각 시료 상층액 50 µL를 듀플리케이트로 분주합니다.

그런 다음 각 웰에 250 µL의 Sumner 시약을 첨가하고 30 °C에서 15분 동안 배양합니다. 그 후 595 nm에서 흡광도를 측정합니다. RPTC 단층을 차가운 PBS 버퍼로 두 번 세척합니다.

1 mL PBS로 세포를 회수하여 세포 현탁액을 에펜도르프 튜브로 옮깁니다. 원심분리를 통해 RPTC 샘플을 펠렛화하고, ATP 생물발광 분석 키트의 루시퍼레이즈 방법을 사용하여 ATP 함량을 측정합니다. 35 mm 디쉬의 세포 생존율 분석을 위해, 괴사 세포 양성 그룹, 세포 사멸 양성 그룹의 세 가지 대조군 처리 그룹과 염색하지 않은 대조군 두 개의 디쉬를 위해 각각 5개의 RPTC 단층 세포를 사용합니다.

두 번째 세트에 50 millimolar cisplatin 2 µL를 추가합니다. 500 millimolar tert butyl hydroperoxide 2 µL를 추가합니다. 동반 텍스트에 상세히 설명된 대로 propidium iodide를 사용하여 세포를 염색한 후, 결합 버퍼로 단층 세포를 세척합니다.

다음으로, 텍스트 프로토콜에 상세히 설명된 대로 ZI가 접합된 ANNEXIN 5를 사용하여 세포를 염색합니다. 그 후 세포를 조심스럽게 회수하여 500 µL의 결합 버퍼에 현탁시킵니다. 이때 고무 폴리스맨(rubber policeman)을 사용하십시오.

피펫을 사용하여 세포를 단일 세포 현탁액으로 분산시킨 후, 세포 현탁액을 유세포 분석 튜브로 옮깁니다. 세포를 단일 세포 현탁액으로 분산시킵니다. 즉시 유세포 분석을 통해 PI 및 FE의 형광을 정량화합니다. CD NA 코팅된 protein kinase C epsilon의 지속적으로 활성화된 돌연변이체와 비활성 돌연변이체의 아데노바이러스 전달 결과, RPTC 및 미토콘드리아 내의 protein kinase C epsilon 단백질 수준이 유의하게 증가하였습니다.

예상한 바와 같이, 효소의 constitutive active 형태는 RP tcs에서 인산화되는 반면, dominant negative 효소는 인산화되지 않습니다. 활성형 protein kinase C epsilon의 존재는 미토콘드리아 에너지원에 사용된 기질과 관계없이 RPTC의 미토콘드리아 호흡을 감소시킵니다. 그러나 비활성형 protein kinase C epsilon은 미토콘드리아 호흡에 아무런 영향을 미치지 않습니다.

흥미롭게도, RP TCS에서 protein kinase C epsilon의 활성화는 4개 중 1개 복합체의 활성을 감소시킵니다. 이러한 RPTC 호흡의 감소는 미토콘드리아 막 전위의 증가와 관련이 있습니다. 우성 음성 돌연변이체(dominant negative mutant)는 이러한 효과를 나타내지 않습니다.

이러한 변화는 활성 protein kinase C epsilon을 과발현시킨 RPTC에서 분리한 미토콘드리아 내 TP synthase의 활성 감소와 함께 나타납니다. 결과적으로, 활성 protein kinase C epsilon을 과발현시킨 RPTC의 ATP 함량은 감소하며, protein kinase C epsilon의 지속적인 활성화는 미토콘드리아 분절화(mitochondrial fragmentation)에서 알 수 있듯이 미토콘드리아 형태에 지대한 영향을 미칩니다.

프로테인 키나아제 C의 억제가 아닌 활성화는 RPTC 형태의 변화를 일으켜 세포 수축과 생존 세포의 신장을 유발합니다. RPC에서 활성 프로테인 키나아제 C epsilon을 과발현시켰을 때 나타나는 이러한 미토콘드리아 효과는 온코시스(ons)와 아포토시스 모두에 의한 세포 사멸과 상관관계가 있었습니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 아데노바이러스 기법을 사용하여 일차 배양 세포에서 단백질을 과발현시키는 방법과 TP 합성을 위한 미토콘드리아 능력을 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 숙달되면, 적절하게 수행했을 때 이 기법은 4시간 이내에 완료할 수 있습니다. 그리고 효율적으로 수행하십시오. 아데노바이러스 작업에는 위험이 따르므로 적절한 예방 조치를 취하는 것을 잊지 마십시오.