리빙 셀의 Subcellular 수준과 초 Timescale에 작은 GTPase 활동의 Spatio-시간적 조작

이 비디오는 UV 광선을 사용하여 세포막에 있는 단백질의 활성을 조절하는 방법을 보여줍니다. 이를 위해 세포에 막 결합형 FRB 단백질과 FKBP가 융합된 표적 단백질을 공동 형질전환(cot transfected)합니다. 그 후 배지에 광케이지드(photo caged) 라파마이신 유도체를 첨가합니다.

그 후 라이브 셀 이미징 중에 세포의 특정 영역에 UV 광선을 조사합니다. 라파마이신(rapamycin)과 비오틴(biotin) 사이의 링커가 절단되어 화학적 이량체화제와 그 부산물이 방출되며, 방출된 이량체화제는 세포 내로 확산되어 조사된 영역 내에서 FKBP가 표지된 표적 단백질과 세포막에 고정된 FRB 사이의 이량체화를 유도합니다. UV 조사가 없으면 FKBP와 FRB는 결합하지 않으므로 아무런 효과가 나타나지 않습니다.

데이터 분석 결과, 관심 있는 FKBP 융합 단백질이 생리학적 효과에 기반하여 매우 국소적으로 모집됨을 알 수 있습니다. 약리학적 또는 유전학적 접근 방식과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 장점은 작용 속도, 표적 특이성 및 공간 해상도의 결합에 있습니다. 이 기술의 활용 가능성은 암세포의 이동 결과로 나타나는 암 전이 치료로까지 확장됩니다.

따라서, 핵심 이동 인자의 활성을 조절함으로써 정확한 분자적 메커니즘을 밝혀낼 수 있으며, 이는 치료 및 완치를 위한 필수 전제 조건입니다. 시연 절차는 본 연구실의 대학원생인 Chris Paul Meyer와 기술원 Bob de Rose가 진행하겠습니다. 멸균된 마이크로 원심분리 튜브에 플라스미드 DNA, membrane tethered FRB, FLUORESCENTLY tagged FKBP, TIA one 및 탈이온수를 혼합하여 프로토콜을 시작하십시오. 혼합물에 1 µL의 a few gene HD를 첨가하고 볼텍싱합니다.

튜브를 실온에서 20분 동안 배양합니다. 배양하는 동안, 8-웰 글라스 챔버 슬라이드의 각 웰에 poly-L-lysine 50 µL를 첨가하고 1분 동안 배양하여 표면을 코팅한 후, 용액을 흡입하여 제거하고 각 웰의 중앙을 탈이온수 50 µL로 세척합니다. 다음으로 80~85% 정도로 confluence 상태인 NIH 3T3 세포를 trypsin 처리합니다.

세포가 분리된 후, 10% FBS가 포함된 DMEM 10 milliliters를 첨가하고, 현탁액 375 microliters를 15 milliliter 멸균 튜브로 옮겨 1,500 G에서 3분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 10% FVS가 포함된 DMEM 750 microliters를 첨가하고 재현탁합니다.

피펫으로 부드럽게 여러 번 상하로 섞어 펠렛을 현탁합니다. 마지막으로, 세포 현탁액을 형질전환 용액에 넣고 피펫 팁으로 살살 저어준 뒤, 챔버의 각 웰에 세포 형질전환 현탁액 250 µL를 분주합니다. 슬라이드를 밀어 넣고 배양합니다.

37 °C에서 15~18시간 동안 유지합니다. 케이지 라파마이신(cage rapamycin), 비오틴 부가물을 합성하려면, 먼저 멸균된 원심분리 튜브에 DMSO를 사용하여 1 mM 농도의 CRB 스톡 용액을 준비합니다. 별도의 1.5 mL 미세 원심분리 튜브에 1 mg의 avadon을 250 µL의 PBS에 녹입니다.

다음으로, caging moiety를 rapamycin에 접합합니다. 용해된 AVID에 CRB 스톡 용액 0.5 µL를 첨가하고 여러 번 뒤집어 섞은 후, 실온에서 15분 동안 배양합니다. 결합되지 않은 저분자 물질을 제거하고 CRB AVID 접합물을 정제하기 위해, G 25 크기 배제 컬럼을 PBS 300 µL로 평형화합니다.

컬럼이 평형 상태에 도달한 후 5회 반복합니다. CRBA 용액 125 µL를 컬럼의 중앙 베드에 로딩합니다. 그 다음 실온에서 800 G로 2분 동안 원심 분리하여 용액을 내립니다. 세포 형질전환 후, 통과액을 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 수집합니다.

세포를 혈청 결핍 상태로 만들기 위해 배지를 FBS가 포함되지 않은 DMEM으로 교체하고 12시간 동안 배양합니다. 배양 후, 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거하고 준비된 1 µM CRBA 용액 250 µL를 첨가합니다. 다음으로, 살아있는 세포 내의 단백질 동역학을 시각화하기 위해 365 nm UV LED 광원을 위한 결합 광학계가 갖춰진 UV 조명 스피닝 디스크 공초점 현미경을 사용합니다.

에피 형광 조명을 사용합니다. UV 광에 의해 여기되는 형광 염료가 코팅된 유리 플레이트를 사용하여 조사 스폿의 좌표와 크기를 정의합니다. 이를 통해 조사될 영역을 미세하게 조정할 수 있습니다.

100 x 대물렌즈와 epi 형광 조명을 사용하여 세포가 담긴 챔버 슬라이드를 스테이지 위에 놓습니다. 세포의 초점을 맞추고 관찰할 세포를 찾습니다. 이미지 촬영의 경우, 생리학적 효과의 배경 수준을 결정한 후 세포 촬영을 시작합니다.

여기서는 세포의 선택된 한 구역에 UV 광선을 조사하여 언케이지드(uncaged) rapamycin을 해리시킴으로써 막 러플링(membrane ruffling)을 측정합니다. 우선 rapamycin을 DMSO에 녹인 후 PBS로 희석하여 최종 농도를 400 nanomolar로 맞춥니다. 전신 효과를 유도하기 위해 이 용액 100 microliters를 이미징 챔버에 첨가합니다. RAC의 국소적 활성화가 국소적 러플 형성을 유도할 수 있는지 판단하기 위해 20분 동안 15초 간격으로 형광 이미지를 캡처합니다.

NIH 3T3 세포에 YFP가 표지된 RAC 활성화제 FKbp, TIA1 및 막 결합 형태인 LDR을 형질전환시켰습니다. 노란색 원으로 표시된 세포 가장자리에 FRB를 국소 조사한 후, 1063초부터 수은 램프를 이용해 1초 동안 전체 조사를 수행하였습니다. 여기서 볼 수 있듯이, 초기에는 막 러플링(membrane ruffling)이 거의 나타나지 않았습니다.

하지만, 전체 조명 및 rapamycin 첨가 후에는 국소 조명에 따라 공간적으로 제한된 러플링(ruffling)이 관찰되었으며, 이는 FK bp TIA one의 세포막 전위를 유도합니다. 세포는 전체적인 러플 형성 양상을 보였으며, 이는 이전에 관찰된 국소적 러플 형성이 rac의 공간적으로 제한된 활성화에 의해 유도되었음을 나타냅니다. 정량적 분석을 위해 표적 세포를 4분면으로 나누었으며, 이 그래프에서 보는 바와 같이 국소 자극 및 전체 자극 후 각 분면에서의 러플 형성 빈도를 측정하였습니다.

벌크 배지에서 Aden의 유무와 관계없이 UV 조사나 국소 UV 조사 없이 CRBA를 처리했을 때, 관찰된 세포 중 어느 것도 러플(ruffle) 형성을 보이지 않았습니다. 하지만 CRBA를 첨가하고 UV 조사를 수행했을 때, 전체 조사를 한 경우에는 모든 사분면에서 약 90%의 동일한 비율로 러플 형성이 관찰되었습니다. 반면, 1사분면만 조사했을 때 러플 형성 빈도는 100%였으며, 이에 비해 2사분면부터 4사분면까지는 각각 30%, 25%, 30%였습니다. 이러한 결과는 라파마이신의 국소적 언케이지징(uncaging)을 통해 단일 세포 내에서 매우 국소적인 생리학적 효과를 유도할 수 있음을 나타냅니다.

이 사례는 rack 활성화로 인해 유발된 세포막 러플링(membrane ruffling)을 보여줍니다. 이 영상을 시청한 후에는 빛을 이용해 소형 G TPA 활성의 시공간적 제어를 달성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 방법은 특정 단백질의 세포막 전이에 의존하는 모든 생리적 과정에 적용될 수 있습니다.

본 실험 절차를 수행할 때, 각 단계마다 용액, 시약 및 세포를 새로 준비하는 것이 중요합니다. UV 광선을 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, UV 보호 안경과 같은 보호 장구를 항상 착용해야 함을 유념하십시오.