형광 - 현미경 검사와 차세대 장면 : Organelle 무결성에 관련된 유전자의 식별을위한 유용한 도구

본 실험의 목적은 식물 세포 소기관의 형태적 및 기능적 무결성을 담당하는 유전자 또는 유전자들을 식별하는 것입니다. 이를 위해 먼저 세포 소기관 형광 마커가 도입된 애기장대 종자에 화학적 돌연변이 유발제로 에틸 메탄 설포네이트(Ethyl methane sulfonate)를 처리합니다. 그 다음 단계로, 첫 번째 돌연변이 세대(M1)의 개별 식물에서 종자를 수집하여 후속 돌연변이 세대인 M2 계통을 육성합니다.

다음으로, confocal 또는 형광 현미경을 사용하여 Eliana 종자의 돌연변이 유발물을 관찰함으로써 비정상적인 소기관 표현형을 식별합니다. 마지막 단계는 세 번째 돌연변이 세대를 생성하고 돌연변이 표현형의 존재를 확인하는 것입니다. 최종적으로, 차세대 염기서열 분석 도구를 사용하여 열성 돌연변이의 위치를 매핑할 수 있습니다.

돌연변이 유전자의 위치가 확인되면, 야생형 유전자를 형질전환하여 비정상적인 세포소기관 표현형을 복구해야 합니다. 이 방법은 식물 세포소기관의 형태적 및 기능적 무결성 유지에 관한 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. Atil methanes, sulfonate 처리를 atop sta 종자에 실시하면 게놈 내 시토신 타이밍 변화가 유도되어 시토신 gwan to timing이 발생합니다.

돌연변이 유도. M2 개체 내에서 최적의 돌연변이 비율을 확보하기 위해 EMS 처리는 이 프로토콜의 핵심 단계입니다. 우선, 관련 소기관 형광 마커를 운반하도록 미리 제작된 야생형 Columbia Ecotype Arabidopsis 종자를 준비합니다.

0.8 g 또는 약 40,000개의 종자를 50 mL 팔콘 튜브에 옮깁니다. 그 다음 증류수 25 mL와 0.2% Ethel methane sulfonate를 추가합니다. 혼합물을 저속 돌연변이 유발 믹서에서 16시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 액체를 흡입하여 1 M 수산화나트륨이 담긴 플라스크에 버립니다.

EMS를 불활성화하려면 종자가 들어 있는 Falcon 튜브에 물 25 milliliters를 추가하십시오. 튜브를 닫고 5회 뒤집어 종자를 세척합니다. 모든 종자가 가라앉으면 물을 흡입하여 1 molar 수산화나트륨 플라스크에 버립니다.

이 세척 단계를 최대 10회 반복한 후, 마지막 세척 단계에서 최소량의 물로 종자를 헹굽니다. 10% bleach 25 milliliters를 첨가하고 30초 동안 격렬하게 흔들어 종자 멸균을 진행합니다. 종자가 바닥에 가라앉으면 bleach를 따라내고 멸균수 25 milliliters로 헹굽니다.

멸균수를 제거한 후, 70% ethanol 25 milliliters를 첨가합니다. 튜브를 30초 동안 흔들어 준 다음 씨앗이 바닥에 가라앉을 때까지 기다립니다. ethanol을 따라내고 멸균수 25 milliliters로 헹굽니다.

멸균수로 세척하는 과정을 두 번 반복합니다. 그런 다음 3mm 필터 페이퍼가 깔린 플라스틱 페트리 접시에 종자를 붓습니다. 종자를 4°C에서 이틀 동안 배양한 후, 후드 내에서 건조시킵니다.

종자를 Phytagel이 포함된 1/2 MS 및 Scoog 배지가 담긴 150 millimeter 페트리 접시에 플레이트당 약 250~300립씩 배치하십시오. 겔화제로 Phytagel을 사용하여 M1 세대의 종자를 플레이트에서 2주 동안 배양합니다. 유묘를 토양으로 이식하여 식물이 계속 성장하도록 합니다.

30~45일 후, 식물은 성숙 단계에 도달하며 이때 돌연변이 표현형을 명확하게 확인할 수 있습니다. 이 시점에서 각 M1 식물로부터 두 개의 M2 종자를 수집하여 1000개의 독립적인 M2 라인을 생성합니다. 공초점 현미경 또는 형광 현미경으로 유묘를 관찰하기 위해, 각 M2 라인당 60개의 종자를 플라스틱 페트리 접시의 절반 배지에서 7~10일 동안 배양합니다.

Fighter gel이 포함된 Moreish 및 scoog 배지에서 EMS 처리를 하지 않은 대조군 묘목 5개를 동일한 플레이트에서 배양합니다. 묘목이 성장하면, ABAC 밀봉면이 40배 렌즈를 향하도록 하여 5~10개의 cos lead-in을 현미경 슬라이드에 마운트하고 커버슬립으로 덮은 뒤, 형광 하에서 피질 영역부터 내측 영역까지 각 olein을 관찰하여 오가넬 마커의 세포 내 분포 변화를 확인합니다. 양성 식물을 토양에 이식하고 앞서 설명한 것과 동일하게 묘목을 성장시킨 후, 돌연변이 표현형이 M3 세대에서도 유지되는지 확인합니다.

서면 프로토콜에 설명된 대로, 원하는 오가넬 형광 마커를 포함하는 야생형 게놈으로 최소 3회 역교배하여 오염된 배경 돌연변이를 제거하십시오. 매핑을 시작하려면, cogen DN Easy Z plant mini kit를 사용하여 동형접합 돌연변이 Columbia DNA를 나타내는 M3에서 약 3 µg의 게놈 DNA를 추출하십시오. 이 DNA를 Illumina genome analyzer two 14 시퀀싱에 제출하십시오.

다음 단계는 zago 돌연변이체 Colombia와 Las Berger를 교배하여 자가 수분을 통해 조합이 일어날 수 있는 F1 세대를 생성하는 것입니다. 이후 F2 세대가 생성되며, 이는 궁극적으로 돌연변이를 유발하는 관심 유전자를 포함하는 매핑 집단으로 활용됩니다. 이 집단의 게놈 DNA를 야생형 식물의 게놈 DNA와 비교함으로써 게놈 내 돌연변이의 위치를 식별할 수 있습니다.

F2 식물이 성장한 후, 변이 표현형을 보이는 F2 개체 70~100개와 야생형 표현형을 보이는 F2 식물을 동일한 수로 수집하고, 홀 펀치를 사용하여 각 식물에서 잎 디스크를 채취합니다. 잎 디스크는 동일한 연령의 잎에서 채취해야 합니다. 유사한 양의 DNA를 확보하기 위해, 샘플은 게놈 추출을 위해 개별적으로 또는 그룹별로 처리할 수 있습니다.

이 경우, 각 eend orph 튜브당 5~10개의 샘플을 수집하여 게놈 DNA를 추출해야 하는 튜브의 수를 줄일 수 있습니다. MasterPure Plant Leaf DNA Purification Kit를 사용하여 게놈 DNA를 추출하십시오. 각 샘플에서 얻은 게놈 DNA는 NanoDrop으로 정량할 수 있습니다.

그 다음, 돌연변이형과 야생형 샘플을 분리하여 유지하면서 각 샘플의 DNA를 동일한 양으로 혼합하여 총 300 nanograms이 되게 합니다. 라벨링 반응을 만들기 위해 먼저 2.5 x random primer solution 60 microliters와 물 42 microliters를 첨가합니다. DNA를 95 degrees Celsius 이상의 온도에서 5분에서 10분 동안 변성시킨 후, 샘플을 얼음 위에 올려 DNA를 변성시킵니다. 10 X DN tps 15 microliters를 첨가합니다.

biotin DCTP 및 3 µL의 Glen polymerase를 혼합하여 부피를 맞춥니다. 샘플을 25 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날, 3 M sodium acetate 15 µL와 차가운 100% Ethanol 400 µL를 첨가합니다. 혼합된 샘플을 20,500 ×g에서 15분간 원심분리한 후, -80 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 두 번째 원심분리 후, 펠릿을 차가운 75% ethanol 500 µL로 세척합니다.

DNA 펠릿을 37 °C에서 10분 동안 건조합니다. 펠릿을 100 µL의 물에 다시 현탁하고, 이 중 5 µL를 사용하여 젤 전기영동으로 수율과 품질을 확인합니다. 야생형 F2 식물 풀과 돌연변이 F2 식물 풀로부터 얻은 무작위 표지 반응물을 1% agarose 젤에 로딩하였습니다.

마지막 단계로, 유전자 칩 arabidopsis ath one 게놈 어레이 하이브리다이제이션을 위해 야생형 및 변이형 표지 반응액 95 µL를 보냅니다. 스캐너로 스캔한 후, 생성된 dot CL 파일을 당사 소프트웨어를 사용하여 분석합니다. 소프트웨어를 설치한 후 프로그램을 열고 서면 절차서에 기재된 bioconductor 문자열을 붙여넣으십시오.

그런 다음 return 키를 누르면 array, genotyping and mapping 웹사이트에서 표준 BIOCONDUCTOR 패키지가 설치됩니다. 텍스트에 나열된 파일들을 다운로드하여 바탕화면의 새 폴더에 압축을 풉니다. 유전자 칩 실험에서 얻은 데이터를 야생형 C, L 및 돌연변이 C로 분류합니다. 이제 야생형 C와 돌연변이 C의 유전자 칩 데이터를 해당 폴더로 복사합니다.

다음으로, PC에서 R을 실행합니다. 'file'을 클릭한 후 'change directory'를 클릭합니다. 파일이 포함된 폴더를 선택하고 'file load workspace'를 클릭한 다음, 'A one V five R data open read C do R'을 선택합니다. 메모장을 사용하여 해당 파일을 열고 전체 텍스트를 복사하여 R에 붙여넣습니다. Mac의 경우, 'mis'를 클릭한 다음 'change working directory'를 클릭합니다.

파일이 포함된 폴더를 선택하십시오. workspace load workspace file을 클릭하고 ATH one V five R data를 선택하십시오. 마찬가지로 text edit을 사용하여 SFP R과 MAP R을 모두 연 다음, 해당 텍스트를 콘솔 창의 R로 복사하십시오.

Arabidopsis 정보 리소스 또는 TAIR에서 유전자를 검색하라는 메시지가 나타납니다. 텍스트에 포함된 링크를 복사하여 인터넷 브라우저에 붙여넣으십시오. 창이 나타나며 파일을 열거나 저장할지 묻는 메시지가 표시됩니다.

저장을 선택하십시오. 파일 이름을 지정하고 확장자를 붙이십시오. x ls를 실행하십시오.

그런 다음 저장(save)을 클릭하십시오. 여기에 예상되는 일반적인 결과가 표시되어 있습니다. 유전자 칩 Arabidopsis H one 게놈 어레이에서 얻은 데이터를 분석한 후, 이 그림은 유전자 칩 Arabidopsis, H one 게놈 하이브리다이제이션을 이용한 Columbia zero 돌연변이 매핑의 예를 나타내며, 여기서 수평 막대는 검출 임계값을 나타냅니다.

이 예시의 변이는 1번 염색체에 위치하며, 수직 막대로 구분되어 있습니다. .xls 파일을 열어 매핑된 영역 내 변이체의 좌표를 확인하십시오. 변이체 게놈의 조립된 Illumina 리드에서 단일 염기 다형성 중 특정 EMS 전이(transition)를 식별하십시오.

이 프로토콜에 기술된 접근 방식을 숙달하면, 기존의 매핑 방법과 비교하여 더 짧은 시간 내에 유전자를 매핑하는 데 활용할 수 있습니다.