선충류의 바디 크기 규정에 참여 유전자에 대한 화면으로 RNA로 인한 간섭 수유 전략을 사용하여

이 비디오는 C. elegans의 성장과 신체 크기를 조절하는 유전자를 식별하는 절차를 보여줍니다. RNA 간섭(RNA interference) 또는 RNAi를 사용하여 후보 유전자를 비활성화하기 위해, 먼저 표적 유전자를 겨냥한 이중 가닥 RNA를 발현하는 박테리아가 포함된 플레이트를 준비합니다. 그 후 4단계 유충 단계의 자웅동체(hermaphrodites)를 RNAi 플레이트로 옮깁니다.

성체 초기 단계에 도달하면, 알을 낳도록 새로운 RNAI 플레이트로 옮깁니다. 몇 시간 후, 성체를 제거하여 동기화된 배아 집단을 확보합니다. 원하는 발달 단계에서 후손을 수집하여 슬라이드에 고정합니다.

마지막으로, 벌레의 현미경 이미지를 획득합니다. 이미지 분석을 통해 유전자 불활성화로 인한 신체 크기의 변화를 확인할 수 있습니다. 이 방법은 TGF beta 신호 전달 경로의 조절 인자를 식별하는 데 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 인슐린 신호 전달 경로와 같이 C. elegans의 배아 이후 발달을 조절하는 다른 경로에도 적용될 수 있습니다.

표적 유전자 서열을 일반적인 worm RNAi plasmid인 vector L 4 4 4 0 A에 클로닝하여 이 절차를 시작하고, 재조합 plasmid를 박테리아 균주 HT one 15 DE three에 형질전환하십시오. 형질전환된 박테리아를 25 micrograms per milliliter의 carbonic과 12.5 micrograms per milliliter의 Tetracycline이 포함된 LB agar 플레이트에서 배양한 후, 향후 사용을 위해 단일 클론을 선택하십시오.

한편, 공벡터 L 4 4 4 0를 박테리아 균주 HT one 15에 형질전환합니다. 실험 대조군으로 사용하기 위해, 형질전환된 박테리아를 100 µg/mL의 ampicillin이 함유된 1 mL LB 배지에서 37 °C로 하룻밤 동안 배양합니다.

Tetracycline은 RNAI 효율을 감소시키기 때문에 첨가하지 않습니다. 밤새 배양한 배양액에 100 µg/mL의 ampicillin이 포함된 LB broth 5 mL를 추가로 넣고 37 °C에서 4~6시간 동안 더 배양합니다. 배양이 완료되면, 적절한 클론 이름이 표시된 RNAI worm 플레이트에 실험군 또는 대조군 박테리아 0.5 mL를 접종합니다.

각 조건당 최소 두 개의 플레이트를 준비해야 합니다. 플레이트를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날,

표적 유전자 서열의 포함 여부에 따라 RNAi를 발현하는 박테리아 층이 형성되어 있어야 합니다. 동물들은 이 박테리아를 먹이원으로 사용하게 됩니다. RNAi 급이 플레이트가 준비되면, 백금선 끝을 화염 멸균합니다.

그다음 백금선을 사용하여 6~10마리의 4단계 유충(L4) C. elegans 자웅동체나 성충을 각각의 RNAi 플레이트에 옮깁니다. 자웅동체를 20°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날이면 개체들이 청년기 성충이 됩니다.

이들을 적절하게 라벨링하여 준비한 새로운 RNAI 플레이트로 옮깁니다. 성충이 알을 낳을 수 있도록 플레이트를 20 °C에서 4~6시간 동안 배양합니다. 배양 후, 자손 세대를 동기화하기 위해 플레이트에서 모든 성충을 제거합니다.

성체를 제거한 후, 시간 측정을 시작합니다. 이때를 0시간으로 합니다. 플레이트를 20 °C에서 배양하여 동물이 목표하는 발달 단계까지 성장하도록 합니다.

여기서는 표현형 분석을 위해 청년기 성체를 선택합니다. 정상적인 속도로 발달하는 넉다운(knockdown)의 경우, 72시간의 배양이 필요합니다. 유전자에 따라 동물의 발달에 미치는 영향이 다르므로 배양 시간을 조정해야 할 수도 있음을 유의하십시오.

RNAi로 인해 동물의 성장 속도가 달라지는 경우, VUL 발달이 완료되고 자궁 내에 2~6개의 배아가 있는 L4 단계 이후 24시간 이내의 개체를 성체 초기 단계로 식별할 수 있으며, 이는 여기 표시된 바와 같습니다. 다른 발달 단계를 식별하려면 연구자는 생식샘 및 VUL 발달 상태를 기준으로 삼아야 합니다. 동물이 적절한 단계까지 성장하면, RNAi 처리된 벌레의 신체 크기 표현형을 측정할 준비를 하십시오.

다음으로, 여기에 표시된 것처럼 1 mm 두께의 유리 표본 슬라이드 위에 색상 라벨 테이프를 두 겹으로 붙입니다. 이러한 유리 슬라이드를 두 개 만듭니다. 그 후, 테이프가 붙은 두 슬라이드 사이에 새로운 유리 슬라이드를 놓고, 물에 녹인 2%Agros 한 방울을 떨어뜨립니다.

새 유리 슬라이드의 중앙에 다른 유리 슬라이드를 위에 눌러 얇은 agar 패드를 만듭니다. agar가 굳으면 위에 있던 유리를 제거합니다. agar 패드가 있는 슬라이드가 준비되었으므로 이제 벌레를 접종합니다.

슬라이드에 클론 이름을 표시합니다. aros 패드에 25 millimolar sodium azide 10 µL를 첨가합니다. 그런 다음 이전과 같이 백금선을 사용하여 30~40마리의 개체를 sodium azide 용액으로 옮깁니다.

동물을 고정하기 위해 상단에 커버 슬립을 덮습니다. 재조합 및 공벡터 L 4 4 4 0 RNAi 처리 동물 모두에 대해 이 과정을 수행합니다. 다음으로, 2.5 x 대물렌즈가 장착된 해부 현미경 아래에 마이크로미터 슬라이드를 놓습니다.

Q Capture 또는 유사한 소프트웨어를 사용하여 마이크로미터 자의 이미지를 캡처하고 저장합니다. 그 다음, 현미경 아래에 벌레를 배치하고 이미지를 캡처합니다. 먼저 체장을 측정하려면 Image Pro 소프트웨어에서 마이크로미터 자 이미지를 엽니다.

그런 다음 measure를 클릭하고 calibration을 선택하십시오. 이어서 calibrate the active image가 선택된 상태에서 spatial Calibration wizard를 선택하십시오. Next를 클릭하십시오.

캘리브레이션 이름을 입력하고 공간 참조 단위가 마이크론(microns)으로 설정되었는지 확인하십시오. 그런 다음 '참조 캘리브레이션 생성(Create a reference calibration)' 버튼을 체크하고 '다음(Next)'을 클릭하십시오. '참조선 그리기(draw reference line)'를 클릭하십시오.

참조 스케일 바가 나타납니다. 마이크로미터의 양 끝에 맞게 스케일 바의 위치를 조정하십시오. 그다음 해당 참조 표시가 1000 단위를 나타냄을 지정하십시오.

확인을 클릭합니다. 다음 및 완료를 누릅니다. 소프트웨어 보정이 완료되면 벌레 이미지를 엽니다.

그런 다음 measure 메뉴에서 calibration을 선택하고, select spatial을 클릭합니다. 드롭다운 메뉴에서 마이크로미터 보정을 위해 생성한 파일 이름을 선택하십시오. 그 후, 열리는 창의 measure 메뉴에서 measurements를 선택합니다.

자유 그리기 도구를 선택하고 컴퓨터 마우스를 사용하여 동물의 머리부터 꼬리까지 몸의 중심을 따라 선을 그립니다. 측정된 길이는 창에 표시됩니다. 시야 내의 모든 동물에 대해 이 과정을 반복하십시오.

길이 측정값을 Microsoft Excel 파일 또는 기타 적절한 통계 소프트웨어로 내보내십시오. 각 샘플의 평균과 표준 편차를 계산하여 데이터를 분석하십시오. 그 다음, Student's T-test를 사용하여 각 그룹의 결과를 비교하십시오.

변환 성장 인자 베타(transforming growth factor beta) 또는 TGF beta 슈퍼패밀리 단백질 DBL1은 TGF beta 경로의 활성화에 필수적입니다. 신호 활성화에 반응하여 세포 내 smad 신호 전달 단백질이 핵으로 이동하여 유전자 전사를 개시합니다. TGF beta 경로가 억제된 개체는 야생형 동물보다 체장이 짧은 것을 포함하여 체구 크기가 더 작음을 확인할 수 있습니다.

따라서 *C. elegans* 스크리닝을 수행합니다. 체구 돌연변이체는 먹이 공급을 통한 RNAi의 효율성을 테스트하여 체구 돌연변이체를 식별함으로써 TGF beta 신호 전달 성분 및 조절 인자를 찾아낼 수 있습니다. RNAi를 사용하여 4가지 서로 다른 *C. elegans* 균주에서 DBL-1 경로 성분인 SMA-3 및 SMA-6를 녹다운시켰습니다.

테스트된 C elegance 균주는 RNAi 과민성 균주인 Lin 15 B와 RF three를 포함하여, 표준 야생형 균주인 N two 및 RNAi 민감도가 N two와 유사한 것으로 나타난 LIN 36 균주입니다. SMA three 또는 SMA six의 발현이 억제되었을 때, Lin 36에서의 SMA six RNAi를 제외하고 모든 동물은 대조군 동물보다 체구 크기가 유의미하게 작았습니다. RF three의 배경입니다.

RNAi 처리 후 청년기 성체의 배경 체장은 벡터 단독 처리군의 84~95%였습니다. A one Lin 15 B 배경의 경우, RNAi 처리 후 청년기 성체의 체장은 대조군 동물의 68~86%였습니다. 그러나 A one lin 15 B 계통은 자손 수를 적게 생성합니다.

이로 인해 이들은 대규모 스크리닝에 부적합합니다. 따라서 이러한 기술에는 RF 세 가지 균주(RF three strain)의 사용이 권장됩니다. 이 영상을 시청한 후에는 RNI 간섭 기술을 이용하여 성장과 체구 크기를 조절하는 유전자를 식별하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.