모터 뉴런에 마우스 배아 줄기 세포의 효율적인 분화

본 실험 절차의 전체적인 목적은 마우스 배아줄기세포를 운동 뉴런으로 분화시키는 것입니다. 먼저 마우스 배아줄기세포를 마우스 일차 배아 섬유아세포 상에서 배양하고, 백혈병 억제 인자(leukemia inhibitory factor)를 첨가합니다. 그 다음 noggin, bFGF 및 FGF8을 추가하여 신경화 과정을 촉진합니다. 이후 레티노산(retinoic acid) 및 smoothened agonist와 함께 배양하여 운동 뉴런 분화를 유도하며, 이어서 축삭 신장과 운동 뉴런 성숙 단계를 거칩니다.

마지막으로, 면역형광현미경을 사용하여 강한 GFP 형광을 발현하는 분화된 MES 세포를 검사합니다. 다량의 운동 신경세포를 생성함으로써 기존의 프로토콜과 비교하여 운동 신경세포 질환 연구가 용이해졌습니다. 마우스 배아줄기세포를 운동 신경세포로 분화시키는 이 접근법은 더욱 효율적입니다. 이 방법은 척수성 근위축증에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

이는 근위축성 측색 경화증과 같은 다른 운동 신경세포 질환에도 적용될 수 있습니다. 일차 배아 생쥐 섬유아세포를 분주하려면, 100mm 조직 배양 접시 4개를 0.1% 젤라틴 용액 8mL로 코팅합니다. 실온에서 30분 후, 과잉 액체를 제거합니다. 이제 활성화된 PMEF 내의 mitomycin C 한 바이알을 PMEF 배지 40mL에 희석하여 4개의 접시에 분주하고 최대 일주일 동안 배양합니다.

다음으로, 37°C 항온수조에서 MES 세포 1개 바이알을 해동합니다. 15mL 튜브에 담긴 5mL의 E ES 배지로 세포를 세척합니다. 800 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다.

상층액을 흡입하여 제거하고, 신선한 백혈병 억제 인자(leukemia inhibitory factor)가 첨가된 ES 배지 20 milliliters에 MES 세포를 재부유합니다. PMEF 배양액에서 배지 10 milliliters를 제거한 후, 이를 HBG three ES 세포 현탁액 10 milliliters로 교체합니다. 플레이팅 후 24시간째의 작은 콜로니에서부터 72시간째에 직경 약 100 micrometers 크기의 콜로니가 될 때까지 MES 세포의 진행 과정을 관찰합니다.

MES 세포 유도를 위한 세포 증식을 유지하기 위해 배지를 매일 교체합니다. 운동 뉴런으로의 분화 과정입니다. 마우스 배아 줄기세포를 먼저 PMEF 피더 세포로부터 분리한 후, 유도 당일에 부유 배양 환경에서 배양해야 합니다.

100 mm ES 배양액 각각에 대해, 0.1% 젤라틴이 코팅된 T25 플라스크를 준비합니다. 상온에서 30분 후, 과잉 젤라틴을 제거하고 PBS로 3회 세척합니다. ES 배양액에서 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거하되, 느슨하게 부착된 콜로니가 떨어지지 않도록 주의합니다. 그런 다음 10 mL PBS로 1회 세척합니다.

이제 MES 세포를 PMEF로부터 분리하기 위해 0.25%trypsin EDTA 3mL를 첨가하고 3~5분 동안 배양합니다. 37°C에서 줄기세포와 PMEF가 플레이트에서 떨어져 나왔는지 확인합니다. 그런 다음 신선한 ES 배지 15mL를 첨가하고 피펫팅을 통해 콜로니를 분산시킵니다.

세포 현탁액을 준비된 젤라틴 코팅 T one 50 플라스크로 옮기고, PFS가 젤라틴 처리된 표면에 부착될 수 있도록 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 이제 부유하는 MES 세포를 50 mL 튜브에 수확하고 원심분리를 통해 펠릿화합니다. 세포를 10 mL의 신경 분화 배지에 재현탁합니다.

헤모사이토미터를 사용하여 배지를 계수한 후, 분화 단계에서 100mm 현탁 배양 접시에 도말합니다. 1일 차에 현미경을 통해 MES 세포가 배아체라고 불리는 작은 부유 응집체를 형성했는지 확인합니다. 접시에 부착된 PMEF가 남아 있을 수 있으므로, ES 현탁 세포와 배지를 15mL 튜브로 옮긴 다음 500 RPM에서 3분 동안 원심 분리합니다.

배아체(embryonic bodies)를 수확하려면 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거하고, 펠렛 형태의 EB에 10 milliliters의 신선한 신경 분화 배지를 첨가한 후, 세포를 새로운 박테리아 배양 접시에 분주하여 분화 상태로 24시간 동안 배양합니다. 2일째에 배양 접시를 흔들어 섞은 후 배지와 EB를 15 milliliter 튜브로 옮깁니다. EB가 중력에 의해 가라앉을 때까지 기다린 다음, 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거하고 10 milliliters의 운동 뉴런 분화 배지로 EB를 재현탁합니다.

분화 유도를 위해 새 세균 배양 접시에서 5일 동안 EBS를 배양합니다. 7일 차에 EBS의 직경이 약 150에서 200 µm인지 확인하고, 분화 시 강한 GFP 신호가 발현되는지 확인합니다. EBS를 해리하기 이틀 전인 5일 차에 24웰 플레이트 바닥에 12 mm 원형 커버슬립을 배치합니다.

그 다음 100 µg/mL poly DL ornithine 0.5 mL를 추가하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 조직 배양 후드 내에서 poly DL ornithine을 흡입하여 플레이트와 커버슬립을 공기 건조시킵니다. 플레이트 웰을 2회 증류수로 세 번 헹굽니다.

커버슬립을 코팅하기 위해 공기 중에서 건조시킵니다. 차가운 1X PBS 5 mL에 2 µg/mL 농도의 마우스 laminin을 신선하게 희석합니다. 웰당 0.5 mL씩 넣고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

분화 단계에서 PBS로 2회 세척합니다. 7일째에 EBS를 15 milliliter 튜브에 수집하고 중력에 의해 EBS가 가라앉도록 둡니다. PBS로 4회 세척한 후, ACU max 1 milliliter를 EBS에 첨가하여 부드럽게 혼합하고 실온에서 5분 동안 배양한 다음, EBS를 덮고 있는 과량의 ACU max를 흡입하여 제거합니다.

이제 3 mL의 MND 배지를 추가하고 1 mL 일회용 마이크로 파이펫을 사용하여 약 20회 파이펫팅하여 EBS를 해리한 다음, 상온에서 2분 동안 배양하고 세포 현탁액을 셀 스트레이너 캡을 통해 12 x 75 mm 튜브에 통과시킵니다. 필터에 걸러진 나머지 덩어리와 세포에 대해 이 해리 단계를 반복하여 최종적으로 6 mL의 단일 세포 현탁액 내 단일 세포 수득률을 높입니다. 단일 세포 현탁액을 부드럽게 섞고 헤모사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정한 후, 세포를 완전 MND 배지로 희석하여 2 x 10⁵ cells/mL 밀도로 플레이팅합니다.

poly DL ornithine laminin이 코팅된 커버슬립이 들어 있는 준비된 24웰 플레이트의 각 웰에 0.5 milliliters의 세포 현탁액을 넣습니다. 분화된 세포는 2일 후에 긴 신경돌기를 뻗습니다. 배양 시, HBG three는 운동 신경원 특이적 프로모터인 HB nine의 제어 하에 EGFP를 발현하는 형질전환 생쥐로부터 유래된 ES 세포주이며, 정해진 분화 프로토콜을 따릅니다.

MES 세포는 운동 뉴런을 유도하는 데 사용될 수 있습니다. 미분화된 MES 세포는 섬유아세포 피더 층 상단에 둥근 콜로니를 형성합니다. 이들은 약한 GFP 발현을 나타냅니다.

이 MES 세포들을 피더 층에서 분리하여 저부착 디쉬에서 배양함으로써 배아체를 형성하였습니다. 분화된 MES 세포들은 7일 이후에 강한 GFP 형광을 발현하였습니다. 분화된 EBS를 해리하여 poly DL-ornithine laminin이 코팅된 플레이트에 플레이팅하였습니다.

분화된 세포들은 배양 2일 후 플레이팅된 세포체로부터 긴 신경 돌기를 뻗으며, MES 세포 유래 운동 신경세포는 면역형광 염색을 통해 특징지어질 수 있습니다. 이러한 GFP 양성 세포들은 범-신경세포 마커인 neurofilament와 두 가지 운동 신경세포 특이적 마커인 Eyelid one 및 choline acetyl transferase를 발현합니다. DPI는 핵을 함께 염색합니다.

본 2단계 분화 프로토콜은 MES 세포를 척수 운동 신경세포로 분화시키는 효율적인 방법을 제공합니다. 이 영상을 시청한 후에는 마우스 배아 줄기 세포를 운동 신경세포로 효율적으로 분화시키는 방법에 대해 이해하게 될 것입니다. 결론적으로, 고품질의 마우스 배아 줄기 세포를 확보하는 것이 운동 신경세포를 효율적으로 생성하기 위한 가장 중요한 파라미터임을 기억하십시오.