유전자 가족 걸어갔다 통해 공학 및 합성 Adeno-관련 바이러스의 진화 (AAV) 유전자 치료 벡터

다음 실험의 전반적인 목표는 원하는 특성을 가진 입자를 선택할 수 있도록 매우 다양한 합성 아데노 부속 바이러스(aav) 캡시드 라이브러리를 구축하는 것입니다. 이는 먼저 제어된 DNAse I 소화를 통해 복제된 aav 캡시드 유전자를 단편화함으로써, 이후 두 번의 PCR 반응을 통해 이들이 키메라 서열로 재조립될 수 있도록 유도하여 달성됩니다. 두 번째 단계로, 생성된 PCR 산물을 다시 복제 가능 aav 컨스트럭트에 클로닝하여 최소 100만 개의 서로 다른 aav 캡시드 유전자로 구성된 플라스미드 라이브러리를 제작합니다.

다음으로, 이 플라스미드 라이브러리를 2 9 3 T 세포에 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드와 함께 트랜스펙션하여, 이후 표적 세포나 동물에서 선택 가능한 키메라 바이러스 라이브러리를 생성합니다. 결과는 배양 세포 또는 성체 마우스에서 강화되거나 더 특이적인 리포터 유전자 발현을 기반으로, 새로운 합성 A A V 벡터의 성공적인 분자 공학 및 진화를 보여줍니다. 펩타이드 디스플레이와 같은 기존 방법보다 이 기술이 갖는 주요 장점은, DNA 패밀리 셔플링을 통해 세포 결합 및 세포 내 이동부터 탈외피 및 핵 내 유전자 발현에 이르기까지 AV 캡시드의 여러 특성을 동시에 변경하고 개선할 수 있는 잠재력이 있다는 점입니다.

이 방법은 특정 치료 응용 분야에 적합한 이상적인 벡터를 얻는 방법이나, 특정 특성을 결정하는 바이러스 캡시드의 도메인을 분석하는 방법과 같이 유전자 치료 및 바이러스학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 본 방법은 HIV를 위한 T-세포나 간염 바이러스를 위한 간세포와 같이 바이러스 표적 세포를 특이적이고 강력하게 감염시키는 AV 벡터의 분자 진화를 가능하게 하므로, 바이러스성 병원체 감염을 포함한 다양한 인간 질환의 치료로 그 영향력이 확대됩니다. 또한, 이 방법은 AV 생물학에 대한 통찰을 제공할 수 있으며 유전자 치료를 위한 AV 벡터를 개선하는 데 사용될 수 있습니다.

이 방법은 형광 단백질, 세 가지 리포터, 세포 효소 또는 RNA 간섭에 관여하는 단백질과 같이 기초 또는 응용 과학적으로 중요한 다른 유전자 가족에도 쉽게 적용될 수 있습니다. 저희는 성체 마우스의 조직 조각에 치료 유전자를 전달하기 위한 적절한 벡터를 찾는 과정에서 이 방법의 아이디어를 처음 얻었으며, 자연적으로 발생하는 모든 AV 혈청형이 인간 집단에서의 높은 보급률로 인한 높은 면역 반응 발생률이나, 배양된 간세포의 in vitro 형질전환 효율은 높음에도 불구하고 in vivo에서의 성능이 저하되는 것과 같은 단점이 있다는 것을 깨달았습니다. DNA 기반의 AV caps 유전자 단편화 및 바이러스 라이브러리 제작의 일부 단계는 경험과 핵심 단계에 대한 인식이 필요하여 습득하기 어렵기 때문에, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 이는 다양한 아데노 부속 바이러스 캡시드 유전자를 충분한 양으로 일상적으로 준비하는 것을 돕기 위함입니다.

DNA 셔플링을 위해 이러한 유전자들은 우선 공통의 플라스미드 백본으로 서브클로닝됩니다. 이를 수행하기 위해, 먼저 cap F 및 cap R 프라이머를 사용하여 일반적으로 사용 가능한 AAV 플라스미드로부터 원하는 cap 유전자들을 PCR로 증폭합니다. 그 다음 cap 유전자들을 특정 프라이머 결합 부위와 제한 효소 부위를 포함하도록 설계된 플라스미드로 클로닝합니다. 본 예시에서는 cap 유전자를 PAC one 및 SC one 부위로 클로닝하는데, 이 부위들은 cap 증폭에 사용된 프라이머와 수용 플라스미드에는 존재하지만, 대부분의 AAV에는 존재하지 않습니다. AAV 캡시드 유전자를 인코딩하는 플라스미드 세트가 생성되면, T3 및 T7 프라이머를 사용하여 선택한 cap 유전자들을 증폭함으로써 cap 셔플링을 위한 PCR 절차를 시작합니다.

200 ng의 cap 플라스미드, 최종 농도 2 µM의 각 프라이머, 10 µL의 5x high five 버퍼 및 1 µL의 high five 폴리머라아제를 포함하는 50 µL PCR 반응액을 준비합니다. 이 반응을 통해 약 3 µg의 PCR 산물이 생성되며, 이는 라이브러리에 포함될 cap 유전자의 수에 따라 최대 6회의 셔플링 반응에 충분한 양입니다. 95 °C에서 5분간 시작한 후, 94 °C에서 15초, 57 °C에서 30초, 68 °C에서 3분으로 구성된 사이클을 40회 반복하고, 마지막으로 72 °C에서 10분간 반응시킵니다.

PCR 산물을 정제한 후, Kyra로 재조립하기 위한 cap 유전자 단편을 생성하기 위해 조절된 DNA 소화를 수행합니다. 이 과정에서 가장 어려운 점 중 하나는 Kyra 재조립에 유용한 특정 범위의 소화된 cap DNA 단편을 얻는 것입니다. 이를 위해 우선 충분한 양의 정제된 cap 유전자를 준비한 다음, 다양한 조건으로 여러 개의 병렬 반응을 설정합니다. 소화 반응을 동일하게 설정하려면, 다양한 cap PCR 산물을 54 µL의 물에 총 4 µg이 되도록 혼합한 후, 6 µL의 DS 반응 버퍼와 0.5 µL의 DNAs one을 반응액에 조심스럽게 첨가합니다. 튜브를 세 번 가볍게 스핀 다운하고 즉시 25 °C 가열 블록에 올립니다.

이 첫 번째 반응을 1분 동안 인큐베이션합니다. 다음으로, 두 번째 소화 반응을 준비하되 25 °C에서 1분 15초 동안 인큐베이션합니다. 이러한 방식으로, 인큐베이션 시간을 15초 간격으로 달리하여 1분에서 2분 사이의 인큐베이션 시간을 갖는 여러 개의 병렬 반응을 설정합니다.

25 millimolar EDTA 6 µL를 첨가하여 각 반응을 중단시킵니다. 튜브를 짧게 볼텍싱하고 75 °C에서 10분 동안 배양합니다. 여러 개의 병렬 반응을 통해 DNA로 소화된 5개의 캡 샘플(다양한 배양 시간에 따른 샘플 1개 포함)을 얻게 되며, 표준 1% AROS 겔에서 캡 단편들을 정제합니다.

이상적으로는, 처음 시작 시 1분, 45초 또는 2분의 배양 시간으로 진행한 이 예시와 같이 100에서 500 base pair 사이의 스미어(smear)가 보여야 합니다. DNA family shuffling에서 캡 조각들은 먼저 부분적 상동성에 기반하여 스스로 프라이머 역할을 하는 PCR을 통해 전체 길이의 서열로 재조립됩니다. 정제된 조각 500 ng, 10 x fusion buffer 10 µL, 10 mM dNTPs 1 µL, DMSO 1.5 µL 및 fusion 0.5 µL를 사용하여 50 µL 반응액을 준비하십시오.

두 개의 중합효소를 98 °C에서 30초 동안 배양한 다음, 98 °C에서 10초, 42 °C에서 30초, 72 °C에서 45초로 구성된 사이클을 40회 반복하고, 마지막으로 72 °C에서 10분 동안 최종 단계를 수행합니다. 다음으로, 보존된 플랭킹 서열에 결합하는 프라이머를 사용하여 2차 PCR을 통해 재조립된 캡 유전자를 증폭하여 후속 클로닝을 준비합니다. 예를 들어, SAF 및 SAR 또는 CUF 및 CUR 프라이머 세트를 사용하여 1차 PCR 산물 2 µL(각 프라이머의 최종 농도는 2 µM), 염화마그네슘 0.5 µL, 5x high-FI 버퍼 10 µL, high-FI 중합효소 1 µL를 포함하는 50 µL 반응액을 조제합니다.

후속 클로닝을 위해 충분히 높은 수율을 확보하려면 16~24회의 PCR을 수행하는 것이 권장됩니다. PCR 산물들을 모아 전체 길이의 캡 밴드(cap band)를 정제한 후, 다음 단계로 정제된 캡 유전자 풀을 PAC one 및 ASC one으로 제한효소 처리하여 복제 능력이 있는 AAV 플라스미드에 클로닝합니다. 수용 플라스미드는 AAV P5 프로모터의 조절 하에 있는 AAV2 rep 유전자를 둘러싼 AAV 역전 말단 반복 서열(inverted terminal repeats)과 PAC one 및 ASC one을 포함하고 있습니다.

rep 하위의 제한 효소 사이트는 셔플링된 cap 풀의 인프레임 클로닝을 가능하게 합니다. 화살표로 표시된 LSE 프라이머 결합 부위는 cap 유전자 서열 분석에 유용합니다. cap 단편과 적절하게 절단된 수용체 플라스미드 백본을 3:1 몰 비로 혼합하십시오. 최종 DNA 농도가 15 nanograms per microliter가 되도록 20회 형질전환에 충분한 총 부피 40 microliter의 마스터 믹스를 조제하십시오.

16 °C에서 하룻밤 동안 배양한 후, 다음 날 라이게이션 반응물을 E. coli에 형질전환합니다. 라이게이션 반응물 2 µL를 전기천공 가능 E. coli 30 µL와 혼합하고, 얼음 위에서 미리 냉각시킨 전기천공 큐벳으로 옮겨 1.8 kV, 200 Ω, 25 µF 조건으로 전기천공을 수행합니다. 시간 상수는 5 ms에 가까워야 하며, 직후에 1 mL의 예열된 SOC 배지를 가하여 250 mL 플라스크로 옮깁니다.

이러한 전기천공법을 20회 수행하면 약 1×10⁶개의 서로 다른 클론 다양성을 가진 라이브러리를 얻을 수 있습니다. 혼합된 형질전환물에 동일 부피의 예열된 SOC 배지를 첨가하고 37 °C, 180 RPM에서 1시간 동안 흔들어 줍니다. 그다음, 혼합된 형질전환물 40 mL를 ampicillin이 포함된 LB 배지 800 mL에 첨가하고 동일한 조건에서 16시간 동안 추가로 배양합니다. 이후 시판 키트를 사용하여 라이브러리 플라스미드 DNA를 정제합니다.

바이러스 라이브러리 제작은 HEC 2 9 3 T 세포에 a a v 라이브러리를 트랜스펙션하는 것으로 시작합니다. 이 절차를 시작하려면, HEC 2 9 3 T 세포를 10개의 15 centimeter square 디시에 분주하고 37 °C에서 48시간 동안 배양하십시오. 각 트랜스펙션마다 다음의 두 가지 시약 혼합물을 두 개의 별도 튜브에 준비합니다. 첫 번째 튜브의 다음 양은 플레이트 10개당 기준입니다.

염화나트륨과 DNA 7.9 milliliters를 혼합하고, 전체 부피가 15.8 milliliters가 되도록 물을 추가합니다. 두 번째 튜브에는 폴리에틸렌아민 3.52 milliliters, 염화나트륨 7.9 milliliters, 그리고 물 4.38 milliliters를 넣습니다. 혼합액들을 합쳐 보텍싱하고 실온에서 10분 동안 배양한 후, 용액을 2 9 3 T 세포가 담긴 각 디쉬에 균등하게 분배합니다. 37 degrees Celsius에서 배양합니다.

48시간 후, 바이러스 라이브러리를 수확할 수 있습니다. 배지로 세포를 긁어내고, 모든 디쉬의 세포를 하나의 튜브에 모은 뒤 1200 RPM에서 15분 동안 원심 분리합니다. 세포 펠릿을 6 mL의 용해 버퍼(lysis buffer)에 재현탁하고 5회의 동결-해동 사이클을 거칩니다. 5회의 동결-해동 사이클이 끝난 후, Ben Nase와 함께 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다.

다음으로, 세포 잔해를 3,750 RPM에서 20분 동안 원심 분리하여 가라앉힙니다. 페이스트 피펫을 사용하여 Beckman Quicks seal 원심 분리 튜브에 바이러스 현탁액 5 mL를 넣은 후, 15%, 25%, 40% idal 용액을 각각 1.5 mL씩 추가하여 정제를 위한 밀도 구배를 설정합니다. 구배의 나머지 부분을 용해 버퍼로 채운 후, 4°C에서 50,000 K로 2시간 동안 초원심 분리합니다.

초원심분리가 완료되면 로터에서 튜브를 꺼내고 튜브 외부를 70% ethanol로 닦아냅니다. 환기를 위해 튜브 상단에 바늘을 꽂고, 다른 바늘을 사용하여 40% IOL 분획 1.2 milliliters를 추출합니다. 25% 분획에는 빈 입자가 포함되어 있으므로 해당 부분에서 추출하지 않도록 주의하십시오.

Aav 캡시드. 원래의 플라스미드 라이브러리에서 추출한 개별 클론들을 사용하여 리콤비넌트 Aav 벡터를 제작함으로써 그 기능성과 다양성을 분석합니다. 리포터 유전자를 발현하는 정제된 바이러스를 서로 다른 양으로 배양 세포 또는 동물에 감염시킨 후, 형질도입 효율을 결정합니다.

여기에 표시된 것은 셔플링된 cap 유전자로 제작된 다섯 가지 서로 다른 재조합 YFP 발현 AAV 벡터를 감염시킨 세 가지 인간 세포주의 형광 현미경 결과입니다. 형질전환 효율을 분석하는 또 다른 방법은 형광 리포터 유전자 발현에 대한 FACS 기반 측정입니다. 이 그림은 원래 라이브러리에서 무작위로 선택하여 셔플링된 cap 유전자로 제작한 18가지 서로 다른 재조합 YFP 발현 AAV 벡터를 감염시킨 네 가지 세포 유형(인간 신장 세포, 인간 자궁경부 세포, 마우스 섬유아세포 및 인간 T 세포)의 전형적인 결과를 보여줍니다.

더 쉬운 시각화를 위해 YFP 발현을 색상으로 구분하였습니다. 묘사된 시각화 자료는 형질전환된 세포의 백분율을 나타내며, 검은색은 0%를, 흰색은 각 세포 유형에서 측정된 최고 수치를 의미합니다. 클론 B 2 Red는 선택되지 않은 캡시드에서 예상할 수 있듯이 전반적인 효능이 낮은 클론의 예시입니다. 이후 바이러스 라이브러리를 스크리닝하여 특정 세포주 또는 동물 모델에서의 선택을 통해 원하는 특성을 대부분 또는 전부 나타내는 단일 입자를 찾아낼 수 있습니다.

배양 세포의 경우, 먼저 세포에 라이브러리의 다양한 분주량과 ENO virus five를 공동 감염시켜 a a v의 성장을 유도한 다음, 세포를 수확하여 증폭된 a a v를 추출하고 이를 새로운 세포에 다시 감염시키는 데 사용합니다. 세포 공동 감염을 위한 최적의 a a v adenovirus 비율을 결정하는 것이 중요하며, 강력한 arius 감염을 판단하는 좋은 척도는 바이러스 접종 3일 후 세포의 원형화 및 탈락으로 나타나는 세포병성 효과의 발생입니다. 이 그림에서 왼쪽 상단 패널은 감염되지 않은 세포를 보여주며, 나머지 패널은 세포당 입자 수로 표시된 양의 adenovirus로 감염된 세포를 보여줍니다. a a v 감염 및 증폭을 확인하는 또 다른 유용한 판독 방법은 고도로 보존된 a a v 캡시드 에피토프를 인식하는 B one 항체를 이용한 western blotting으로 캡시드 단백질을 검출하는 것입니다.

왼쪽 블롯은 다양한 µL 부피의 a a V 라이브러리와 헬퍼 ENO vir를 공동 감염시킨 세포를 보여줍니다. 처음 두 레인은 a a v 단백질 발현이 거의 검출되지 않는 조건의 좋은 예시이며, 이는 a a v 감염 및 증폭이 과도하지 않고 충분하게 이루어졌음을 나타내며, 결과적으로 원하는 정밀한 유전자형-표현형 연관성을 보여줍니다. 따라서, 이러한 상층액 0.11 또는 10 µL를 신선한 세포의 재감염에 사용하였습니다.

웨스턴 블롯 결과가 오른쪽 셀에 표시되어 있습니다. LA c에서는 음성 대조군으로서 a v 단독으로 감염시켰습니다. 또한 DNA 시퀀싱을 통해 반복적인 감염 라운드 동안 라이브러리 다양성을 모니터링하는 것이 매우 중요합니다.

이 도표는 AAV 2, 8, 9를 기반으로 한 라이브러리 유래 AAV 클론들의 선택 전후 단백질 서열 비교를 보여줍니다. 빨간색 선 위의 서열은 부모 AAV를 나타냅니다. 보라색 화살표는 상동 재조합 사건을 나타냅니다. 빨간색 화살표는 모든 선택된 클론에서 확인된 AAV 2와 AAV 9 사이의 교차점을 표시합니다. 동물 내 선택을 위해, AAV 라이브러리를 동물에 주입한 후 대상 세포나 조직에서 PCR로 회수하고, 이를 다시 클로닝 및 재패키징하여 새로운 감염 라운드에 사용합니다.

말초 라이브러리 주입 일주일 후 생쥐 간에서 성공적으로 감염된 a a v 클론을 구조한 예시가 여기에 제시되어 있습니다. 1번 레인은 예상되는 2.2 kilobase 밴드를 보여주며, 2번 레인은 템플릿 비포함 대조군입니다. M 레인의 DNA 마커 밴드 크기는 kilobases 단위로 표시되어 있습니다. 선택 절차와 관계없이, 농축된 캡시드 변이체는 최종적으로 적절한 시스템에서 검증되어야 합니다.

배양 세포에서 농축된 AAV 카이메라(kymera)의 우수한 성능 사례가 여기에 제시되어 있습니다. 색이 진할수록 입자 수당 감염력, 즉 클론의 감염력이 더 높음을 나타냅니다. AAV-DJ는 광범위한 세포주에서 8종의 천연 AAV 야생형 집합보다 뛰어난 성능을 보입니다.

마지막으로, 마우스 간에서 선택된 AAV KYMERA의 분석 결과가 제시되어 있습니다. 거울상 간암 세포에서 AAV DN을 선택한 후, 이를 사용하여 루시페레이스(luciferase)를 발현하는 재조합 벡터를 제작하였습니다. 마우스 간에서 가장 강력한 천연 분리주 중 하나인 야생형 AAV8 기반의 대조군 또는 본 벡터를 동일 용량으로 말초 주입한 후 1주일이 지난 대표 마우스(그룹당 3마리)의 결과입니다. AAV DN 클론의 간 내 전체 발현량은 약간 더 적지만, 이미징 소프트웨어를 통해 간 발현 수준을 조정한 후 확인했을 때 비간 조직에서의 오프타겟팅(off-targeting)이 상당히 적게 나타나 해당 장기에 대해 더 높은 특이성을 보인다는 점에 유의하십시오.

이 기술은 적절하게 수행될 경우 AAV 캡시드 유전자의 증폭부터 바이러스 라이브러리 생성까지 일주일 안에 완료할 수 있습니다. 본 절차를 시도할 때, 여기에 제공된 프로토콜은 천연 AV 혈청형 선택 과정에서의 경험을 바탕으로 도출된 것이며, 다른 사용자가 자체적인 맞춤형 라이브러리를 제작할 때는 일부 조건을 조정하고 미세 조정해야 할 가능성이 높다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차 외에도, 고도로 다양한 라이브러리를 생성하거나 DNA family shuffling을 통해 생성 및 농축된 캡시드의 특성을 더욱 개선하기 위해 AGENESIS를 이용한 펩타이드 디스플레이 부위 지정 돌연변이 유발 또는 PCR 기반 무작위화와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

이 기술은 바이러스 유전자 전달 분야의 연구자들이 HIV 감염 및 T 세포와 같이 기존 AAV 유형으로는 만족스러운 결과를 얻지 못했던 질환 및 관련 표적 세포에 대한 치료 전략을 탐색하고, 인간 줄기세포 및 배양된 다른 난감염성 세포로의 벡터 기반 유전자 전달을 탐색할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 유전자 단편화와 재조합의 조합을 사용하여 매우 다양한 합성 아데노 부속 바이러스 벡터 라이브러리를 설계하고 진화시키는 방법과, 유전자 전달 벡터로 사용하기 위해 원하는 특정 특성을 가진 개별 캡시드를 농축시키고자 배양 세포 또는 동물 모델에서 이러한 라이브러리를 원리적으로 선택하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 아데노바이러스를 다루는 작업은 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 많은 주의를 기울여야 한다는 점을 잊지 마십시오.