마이크로 유체 플랫폼을 사용하여 높은 처리량 단백질 표현 생성기

본 실험 절차의 전반적인 목표는 정제 단계가 필요 없는 모듈식 단백질 어레이를 제작하여 모든 단백질 라이브러리와 호환 가능하도록 하는 것입니다. 이는 먼저 어셈블리 PCR(assembly PCR)을 통해 합성 유전자를 생성함으로써 달성됩니다. 그다음, 합성 유전자들을 에폭시 슬라이드에 어레이 형태로 배치합니다.

실리콘 제어 몰드와 유동 몰드를 사용하여 PDMS로 미세유체 장치를 제작합니다. 그다음, 미세유체 장치를 스폿팅된 DNA 어레이에 맞게 정렬합니다. 마지막으로, 토끼 망상적혈구 용해물을 미세유체 장치 내로 흐르게 하여 단백질을 발현시킵니다.

최종적으로, 형광 항체 표지를 통해 수천 개의 단백질 발현을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 마이크로유체 기반 기술을 사용하면 단백질 마이크로어레이와 같은 기존 방법보다 몇 가지 장점이 있습니다. DNA를 마이크로어레이로 제작한 다음, cellis를 사용하여 장치 내에서 단백질을 생성합니다.

따라서 단백질 정제가 필요하지 않으며 단백질이 건조되지 않습니다. 단백질은 실험 전반에 걸쳐 신선하게 유지됩니다. 또한 미세유체 기술은 더 높은 민감도를 제공합니다. 미세유체 장치를 제작하려면, 엘라스토머 분리를 촉진하기 위해 실리콘 제어 및 흐름 몰드를 chloro trimethyl silene 증기에 10분 동안 노출시키십시오.

베이킹 단계 후, 대조군 몰드와 유동 몰드용으로 각각 5:1과 20:1의 두 가지 다른 비율로 실리콘 기반 엘라스토머와 경화제 혼합물을 준비합니다. 5:1 비율의 PDMS를 대조군 층 위에 붓습니다. 대조군 층의 기포를 제거한 후 80 °C에서 30분 동안 베이킹합니다.

다음으로 20:1 비율의 PDMS 혼합물을 유체층 위에 2,600 RPM으로 60초 동안 스핀 코팅한 후, 80 °C에서 30분 동안 굽습니다. SU-8 패턴이 벗겨지지 않도록 주의하며 몰드에서 제어층을 천천히 분리합니다. 그런 다음 메스를 사용하여 장치의 외곽선을 따라 절단하고, 현미경 하에서 뭉툭한 바늘을 사용하여 제어 채널에 접근하기 위한 구멍을 뚫습니다.

왼쪽 상단 모서리부터 시작하여 흐름 층과 제어 층을 수동으로 정렬하고, 제어 층의 버튼 밸브를 반응 챔버 중앙에 배치하십시오. 다음으로 첫 번째 행을 정렬한 후, 제어 층을 한 행씩 조심스럽게 놓습니다. 모든 버튼 밸브가 반응 챔버 중앙에 위치하고, 어드레스 밸브와 입력 밸브가 흐름 채널의 정확한 위치와 교차하는지 확인하십시오.

모든 행이 정렬될 때까지 이 과정을 국소적으로 반복합니다. 완전히 정렬되면, 측면과 모서리부터 조심스럽게 들어 올려 PDMS의 장력을 제거합니다. 그 후, 장치를 80 °C에서 2시간 동안 베이킹합니다.

주변부를 따라 절단하고 flow mold 펀치 구멍에서 2층 구조의 장치를 벗겨내어, 장치용 DNA 컨스트럭트 생성을 위한 유로(flow channel)에 접근합니다. T7 프로모터, 리보솜 결합 부위(ribosome binding site), 양 끝단에 서로 다른 에피토프 태그가 포함된 오픈 리딩 프레임(open reading frame), 그리고 T7 터미네이터로 구성된 합성 유전자를 생성하기 위해 PCR을 수행합니다. 합성 유전자를 어레이하기 위해 폴리에틸렌 글리콜과 D-트리오스 이수화물 혼합물을 제조합니다. 384 웰 플레이트의 각 웰에 반응당 2 µL씩 분주합니다.

웰 플레이트. 합성 유전자를 384-웰 플레이트에 넣습니다. 그 다음 증류수를 가하여 최종 부피를 20 µL로 맞춥니다.

다음으로, 마이크로어레이 스폿을 사용하여 에폭시 코팅된 유리 기판 위에 일련의 합성 유전자를 배치합니다. 실체 현미경 하에서 마이크로유체 장치를 유전자 어레이에 수동으로 정렬하여, DNA 스폿이 DNA 챔버의 중앙에 위치하도록 합니다. 그런 다음 나머지 행들을 일직선으로 맞춥니다.

PDMS의 응력을 완화하고 마이크로어레이에 잘 결합되도록 장치 전체를 미세 조정하여 마무리합니다. 국소적으로 들어 올립니다. 마지막으로, 80 °C의 핫플레이트 위에서 하룻밤 동안 배양하여 장치를 유리 슬라이드에 결합합니다.

이 섹션에서는 시각화를 위해 식용 색소를 사용합니다. 제어층의 밸브는 LabVIEW를 사용하여 컴퓨터로 작동시킵니다. LabVIEW 스크립트는 전자 제어 박스를 통해 일련의 솔레노이드 마이크로 밸브를 제어합니다.

솔레노이드 밸브 매니폴드는 압축 공기에 연결되어 장치 내 제어 밸브로 들어가는 공기 흐름과 압력을 조절합니다. 내경 0.02 inches의 유연한 플라스틱 튜브와 스테인리스 스틸 핀을 사용하여 장치를 솔레노이드 밸브 매니폴드에 연결하십시오. 튜브를 2중 증류수로 채우고 제어층의 액세스 홀에 핀을 삽입하십시오.

각 튜브가 해당 제어 채널에 연결되었는지 확인하십시오. 제어 채널을 활성화하려면 LabVIEW 애플리케이션을 실행하고 공기압을 5 PSI로 설정한 후, LabVIEW 스크립트에서 밸브를 활성화하여 공기압을 가합니다. 이렇게 하면 물이 PDMS 제어 채널로 밀려 들어가 결함이 있는 장치의 제어 채널 간에 잠재적인 크로스토크(crosstalk)가 있는지 확인할 수 있습니다.

먼저 샌드위치 밸브와 어드레스 밸브를 채웁니다. 제어 채널과 밸브에 물이 모두 채워지면, 밸브를 프라이밍하여 그 아래의 유체 채널을 차단합니다. 우선 공기압을 15 PSI로 높인 다음, 개별 솔레노이드 밸브에 연결된 LabVIEW 프로그램의 온/오프 스위치 세트를 통해 수행합니다.

모든 스위치 버튼을 켜서 밸브를 모두 활성화하여 모든 밸브가 열려 있는지 확인합니다. 튜브를 유체 입력구 중 하나에 연결하고, 4~5 PSI의 압력으로 장치에 공기를 흘려보냅니다. 이렇게 하면 유리 슬라이드에 붙어 있던 밸브들이 떨어지게 됩니다.

이제 장치의 프라이밍이 완료되어 시각화 준비가 되었습니다. 이 섹션에서는 시약의 흐름을 시각화하기 위해 황색 식용 색소를 사용하며, 무색 용액은 이를 나타냅니다. 표면에서 단백질 어레이의 자가 조립을 촉진하고 미세유체 장치 내의 비특이적 흡착을 방지하기 위해 표면을 화학적으로 수식하려면, 먼저 필요한 용액이 담긴 새 튜브를 장치의 유로 중 하나에 연결하십시오. 그런 다음 튜브의 반대쪽 끝을 수동 매니폴드에 연결하고 공기압 흐름을 열어주십시오.

새 튜브에 biotin elated BSA 40 µL를 넣고, 그 중 약 절반을 장치에 20분 동안 흘려줍니다. 각 단계 사이에 50 mM hippies를 사용하여 반응하지 않은 기질을 씻어냅니다. 다음으로, streptavidin 25 µL를 20분 동안 흘려줍니다.

비오틴화 BSA를 처리한 후, 버튼 주변 표면을 처리하기 위해 5분 동안 HEPES로 세척합니다. 버튼 밸브를 닫고 나머지 비오틴화 BSA를 흘려준 다음, 다시 5분 동안 HEPES로 세척합니다. 마지막으로, 버튼 아래에 anti-His tag 어레이를 생성하기 위해 버튼 밸브를 열고 30 µL의 Penta-His biotin을 20분 동안 흘려 장치 위에 단백질 어레이를 형성합니다. 넥 밸브를 열고 rabbit reticulocyte를 흘려줍니다.

장치를 통해 DNA 챔버로 빠르게 결합된 전사 및 번역 반응 용액을 주입합니다. 다음으로, 샌드위치 밸브를 닫아 각 유전자를 주변 환경으로부터 분리하고, 핫플레이트 위에서 30 °C로 2.5시간 동안 장치를 배양합니다. 그런 다음 C mix SI three 항체로 단백질의 말단 부위를 표지합니다.

마지막으로, 532 nanometer 레이저와 575 nanometer 방출 필터가 장착된 마이크로어레이 스캐너를 사용하여 단백질 수준을 측정합니다. 이 그림은 단백질 어레이에서 단백질 발현 수준이 다양하게 나타나는 것을 보여줍니다.

일반적으로 유전자 라이브러리의 20%는 검출 가능한 수준으로 발현되지 않습니다. 배경 수준은 DNA가 점적되지 않은 챔버를 사용하여 결정되었습니다. 따라서 해당 단백질 챔버에서 나타나는 신호는 노이즈 또는 표지 항체의 비특이적 흡착에 의한 것입니다.

적절하게 수행될 경우, 해당 장치 검증에는 4시간이 소요되며 칩 실험에는 5시간이 소요됩니다.