멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법 의해 Nanoparticles과 박테리아의 세포 내면화 분석

다중 스펙트럼 이미징 유세포 분석법을 이용하여 나노입자와 박테리아의 세포 내 유입 기전을 분석합니다. 먼저, 액틴 중합을 억제하기 위해 대식세포를 cytochalasin D로 전처리합니다. 그 후, 나노입자 또는 salmonella를 대식세포 단일층에 첨가하고 배양합니다.

그 후 대식세포를 수확하여 고정시키고, 이미지 스트림을 이용한 분석을 위해 표지합니다. 다색 분광 이미징 유세포 분석기를 통해 나노입자와 살모넬라를 내부화한 세포를 표면에 나노입자와 살모넬라가 결합된 세포와 구분합니다. 분석 결과, cyto klain을 처리하지 않은 세포에서만 살모넬라와 나노입자가 모두 내부화되었음을 알 수 있습니다.

D는 내재화가 actin 의존적임을 시사합니다. 이 기술은 유세포 분석법이나 공초점 현미경법과 같은 기존 방법들에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 우선, 형광 신호 강도를 정확하게 측정할 수 있으며, 서로 다른 세포 특징 간의 공간 해상도를 빠른 속도로 제공합니다.

이 방법은 생체 재료 백신 및 약물 전달 연구뿐만 아니라 호스트-병원체 상호작용 연구의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 여기에는 폴리무수물 나노입자와 박테리아가 이용하는 내부화 경로를 규명하는 것이 포함됩니다. 일반적으로 이 방법에 처음 접하는 사람들은 종종 어려움을 겪습니다.

최적의 형광 신호를 얻기 위해 염료를 적정하는 시간을 갖는 것이 중요합니다. 또한, 소프트웨어를 익히고 분석 템플릿을 생성하는 데에도 시간이 소요됩니다. 저희는 현미경 관찰 및 기타 기술을 사용하는 과정에서 poly hydro 나노입자가 병원체 모방 특성을 나타낸다는 것을 발견하고 처음으로 이 방법 아이디어를 얻었습니다.

그다음, 분석을 수행하기 전에 살모넬라와 꽃가루 하이드라이드 나노입자가 사용하는 내포화 과정을 비교하기 위한 고처리량 시스템이 필요했습니다. 모든 포유류 및 박테리아 세포 배양물을 수확하고 나노입자 현탁액을 준비해야 합니다. 먼저 세포 스크레이퍼를 사용하여 합류된 RAW 264.7 세포를 수확하는 것으로 시작하십시오.

헤모사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정하십시오. 그다음, 0.5 mL의 Complete DMEM 내에서 웰당 5 × 10⁵ cells의 밀도로 24-웰 배양 접시에 세포를 분주하십시오. 37 °C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양하십시오.

Salmonella tarica를 준비하려면, 16 by 125 mm 오토클레이브 스크류 캡 유리 배양 튜브에 들어있는 RAW 264.7 세포당 감염 다중도(multiplicity of infection)가 100이 되도록 C-D-M-E-M에서 Salmonella를 희석합니다. 다음으로, 멸균된 유분지(weigh paper)를 사용하여 2009년 Pharmaceutical Research에 발표된 Rean 동료들의 설명대로 제작된 1% FITC 함유 폴리무수물 나노입자 5 mg을 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 정밀하게 잽니다. 이 나노입자를 차가운 인산염 완충 식염수(PBS) 0.5 mL에 첨가하고 얼음에 둡니다.

튜브를 얼음에 둔 상태를 유지합니다. 마이크로 팁이 장착된 초음파 액체 처리기를 사용하여 현탁액을 4~6 জুল의 강도로 약 25초 동안 초음파 처리합니다. 이제 필요한 모든 세포와 시약이 준비되었으므로, 식세포 작용 분석을 수행할 수 있습니다.

첫 번째 플레이트의 분석을 준비하기 위해 RA W2 64.7 세포가 배양된 24웰 조직 배양 플레이트에 라벨을 붙입니다. 다음 각 샘플은 3중으로 분석합니다: cyto 및 D와 나노입자, cyto 및 D와 salmonella, 배지와 나노입자, 배지와 salmonella 나노입자, salmonella 단독, 그리고 AF six 60 염색 세포 단독입니다. 4°C 대조군은 두 번째 플레이트에서 분석하며, 여기에는 배지+나노입자 및 배지+salmonella가 포함됩니다. 이 낮은 온도에서의 배양은 식세포 작용과 같은 느린 세포 공정을 억제합니다. 유도 1시간 전에 적절한 웰에 5 µg/mL의 cyto 및 D와 C-D-M-E-M을 첨가하고 세포를 37°C에서 배양합니다.

배양 후, 나노입자 현탁액을 볼텍싱하고 적절한 웰에 10 µL씩 분주합니다. 그다음 salmonella를 볼텍싱하여 MOI 100으로 적절한 웰에 첨가합니다. 플레이트를 몇 번 가볍게 두드려 혼합합니다.

그다음 샘플 플레이트는 37 °C에, 음성 대조군 플레이트는 4 °C에서 45분 동안 배양합니다. 배양 후 플레이트를 얼음에 놓고, 기존 배지를 흡입하여 제거함으로써 결합되지 않은 입자, salmonella 및 사멸하거나 떨어진 세포를 제거하기 위해 칼슘과 마그네슘이 없는 ice cold PBS로 세포를 두 번 세척합니다. petal magnesium 사용.

이 단계에서 PBS 전처리를 수행하는 것은 세포가 기질에서 쉽게 분리되도록 돕기 때문에 필수적입니다. 세포를 수집하려면 250 µL의 얼음처럼 차가운 PBS를 첨가하고 웰을 부드럽게 긁어낸 뒤, 수집된 세포를 실리콘 처리된 스냅 캡 마이크로 원심분리 튜브에 피펫으로 옮겨 얼음 위에 보관하십시오. 차가운 세척 버퍼 1 mL를 첨가하여 세포를 세척한 후, 4 °C에서 250 ×g로 10분간 원심분리하십시오. 상층액을 버린 후, 마이크로 원심분리 튜브를 뒤집어 종이 위에 톡톡 쳐서 잔류 버퍼를 제거하십시오.

마이크로 원심분리 튜브를 시험관 랙에 대고 부드럽게 긁어 세포 펠렛을 재현탁합니다. 세포를 고정하기 위해 PBS에 희석된 4%para formaldehyde 100 µL를 첨가하고 15분 동안 그대로 둡니다. 실온에서 perm wash buffer 1 mL를 첨가하여 세포를 세척한 후, 4 °C에서 250 ×g로 10분 동안 원심분리합니다.

상청액을 버린 후, 이전과 동일하게 잔류 버퍼를 제거합니다. 그런 다음 RA W2 64.7 세포를 염색합니다. actin의 경우, Alexa Fluora foid가 포함된 perm wash buffer 100 µL를 첨가하여 15분 동안 six 60에서 반응시킵니다.

실온에서, 염색되지 않은 샘플을 phin이 없는 perm, wash buffer와 함께 배양해야 합니다. 염색 후, 세포를 다시 세척하고 원심 분리한 다음, 1% PFA가 포함된 50 µL의 PBS에 재현탁하여 데이터 수집 시까지 4 °C의 암소에 보관하십시오. 전원을 켜고, image stream을 실행하고 런칭하십시오.

파일 메뉴에서 유체 시스템을 프라임(inspire)하고 초기화하십시오. 기본 템플릿 로드(load default template)를 선택하십시오. 이미지 갤러리 보기 메뉴에서 전체 선택(select all)을 하고 설정 실행(run setup)을 눌러 비즈 이미징을 시작하고, 필요한 경우 코어 트래킹을 조정하여 이미지를 측면으로 중앙 정렬하십시오.

명시야(brightfield) 채널을 선택하고 강도 설정(set intensity)을 클릭합니다. 유속 변동 계수(flow speed coefficient of variation)가 지속적으로 0.2% 미만이 될 때까지 기다립니다. 어시스트(assist) 탭에서 모든 시작(start all)을 클릭하여 보정 및 테스트를 실행하고, 소프트웨어에서 모든 항목이 통과되었는지 확인합니다. 샘플 로드(load sample)를 클릭합니다.

그 후 안내에 따라 가장 밝은 샘플이 담긴 바이알을 배치하십시오. 샘플 로더에 모든 형광 염료가 포함된 상태에서 40배 배율을 선택하십시오. 기기 설정이 완료되면 전체 실험 과정 동안 설정을 변경하지 마십시오.

소프트웨어의 레이저 아이콘을 클릭하여 실험에 사용할 각 레이저를 켜고, 산점도에서 측정된 각 형광색소의 최대 픽셀 값이 104,000 counts가 되도록 레이저 출력을 설정합니다. 원치 않는 객체의 수집을 배제하려면 소프트웨어의 세포 분류기(cell classifier) 창을 클릭하십시오. 그런 다음 세포 데이터만 수집하기 위해, 밝은 시야(brightfield)의 영역 하한 채널 1(area lower limit channel one)을 선택하고 값을 50 µm로 설정합니다. 영역이 50 µm 미만인 객체는 부스러기로 간주되어 수집되지 않습니다.

여기 소프트웨어에서 적절한 채널 아이콘을 클릭하여 수집할 채널을 선택하십시오. 설정 탭에서 채널 1, 2, 3, 4, 5 및 6이 선택되어 있습니다. 파일 번호와 대상 폴더를 입력하십시오.

시퀀스 번호를 1로 설정하고 획득할 이벤트 수를 5,000으로 설정하십시오. Run, acquire를 클릭하여 첫 번째 실험 데이터 파일을 수집 및 저장합니다. FLL을 클릭하고 다음 실험 샘플을 실행하십시오.

모든 실험 샘플을 수집할 때까지 반복합니다. 다음으로, 대조군 분석을 위해 comp settings를 클릭합니다. 이렇게 하면 명시야(bright field)와 산란 레이저(scatter laser)가 꺼지며, acquire 탭에서 모든 형광 채널의 수집이 활성화됩니다.

입력값을 500으로 변경합니다. 그다음 컨트롤 튜브를 배치하고 실행(run)을 클릭합니다. 단일 염색 컨트롤에서 500개의 양성 세포를 수집할 때까지 데이터를 획득합니다.

보정 행렬을 생성하기 위해 실험에 사용된 각 형광색소에 대해 이 과정을 반복합니다. 모든 샘플 이미지를 획득한 후, 바탕화면의 ideas 아이콘을 더블 클릭하여 별도의 분석용 컴퓨터에서 ideas 분석 소프트웨어를 실행합니다. internalization 위저드를 더블 클릭하고 테스트 샘플 RIF 파일 중 하나를 로드합니다.

팝업 창에 테스트 파일 로드 방법이 안내됩니다. 안내에 따라 다음 버튼을 클릭하십시오. 그다음, 새 매트릭스(new matrix)를 클릭하십시오.

이렇게 하면 보정 마법사가 실행됩니다. 안내 메시지가 나타나면 단일 색상 대조군 데이터 파일을 선택하여 추가하십시오. 보정 매트릭스 파일이 저장되고 내부화 마법사의 두 번째 단계 상자에 로드될 때까지 안내 지침에 따라 마법사의 다음 버튼을 클릭하십시오.

다음 버튼을 클릭하고 DAF 파일이 생성될 때까지 지침을 따르십시오. 획득 과정에서 사용한 이미지 채널을 선택하여 이미지 표시 속성을 설정합니다. FITC의 경우 채널 2를, AF 660의 경우 채널 5를 클릭하십시오.

기본적으로 명시야(Brightfield)와 측방 산란광(side scatter)이 선택됩니다. 세포 경계를 설정하기 위해 명시야 채널 O를 선택하고, 내부화 프로브를 위해 나노입자나 박테리아가 수집된 채널 O2를 선택하여 단일 세포군을 정의하면, 모든 세포의 명시야 면적 대비 명시야 종횡비의 산점도가 생성됩니다. 여러 데이터 파일의 고처리량 분석을 위해서는 템플릿 파일이 필요하므로, 템플릿 파일을 생성하는 동안 게이트를 신중하게 정의하는 것이 매우 중요합니다.

각 점은 개별 세포 이미지의 값을 나타냅니다. 그래프의 한 점을 클릭하면 이미지 갤러리에서 해당 세포의 이미지를 선택할 수 있습니다.

다음으로, 단일 세포 이벤트에 해당하는 면적과 종횡비를 가진 세포들 주변에 게이트를 그립니다. 단일 세포의 종횡비는 약 1이며, 더블릿의 종횡비는 약 0.5입니다.

여러 세포를 클릭하여 단일 세포 영역과 더블렛(doublets) 또는 잔해(debris) 영역을 구분하십시오. 명시야 이미지의 명시야 그래디언트 제곱평균제곱근(root means square) 히스토그램을 생성하려면 다음 버튼을 클릭하십시오.

그런 다음 인구(population) 탭에서 bin 옵션을 선택하여 선택한 bin을 표시합니다. bin을 클릭하여 세포의 위치와 최적의 초점을 결정합니다. Begin을 클릭하고 선 영역을 그려 초점이 맞은 세포를 게이팅(gait)합니다.

gradient RMS 값이 높을수록 초점이 더 잘 맞은 것이므로, 게이팅할 다른 염색물이 없다면 다음 단계를 건너뛰십시오. X축은 채널 2의 강도, Y축은 채널 2의 최대 픽셀 값을 나타내는 새로운 산점도가 생성됩니다. 점들을 클릭하고 이미지를 확인하여 나노입자 또는 박테리아 양성인 세포 주위에 그릴 영역을 결정하십시오.

내재화(internalization) 특성의 히스토그램은 0에서 시작하는 영역으로 생성되며, 이는 이미지를 관찰하여 조정해야 합니다. 내재화 특성은 세포 전체의 강도에 대한 세포 내부 강도의 비율입니다. 이는 값이 0일 때 강도의 절반이 내부에 있도록으로 스케일링됩니다.

마법사는 세포 표면을 찾기 위해 입력된 세포 이미지를 사용하여 마스크를 생성하고, 이를 4픽셀만큼 침식(erode)시켜 각 세포의 내부를 지정하는 영역을 만들었습니다. 필요한 경우, 먼저 명시야 이미지에서 객체 마스크를 생성한 후 이를 더 많거나 적은 픽셀만큼 침식시켜 다양한 세포 유형에 맞게 이 마스크를 수동으로 조정할 수 있습니다. 내재화(internalization) 기능은 소프트웨어의 알고리즘을 통해 이렇게 침식된 객체 마스크를 기반으로 계산됩니다.

이 기능을 사용하면 마스크 경계 내부에 형광 신호의 대부분이 위치하여 내재화된 입자 및 박테리아를, 이 예시에서 보는 바와 같이 마스크 경계 외부에 형광 신호의 대부분이 위치한 표면 결합 입자 및 박테리아와 구분할 수 있습니다. 침식된 객체 마스크(eroded object mask)를 기반으로 새로운 내재화 특성이 포함된 히스토그램을 생성하십시오. 선택된 빈 모드(bin mode)에서 이미지를 확인하여 내재화된 세포를 게이팅하기 위한 영역을 지정하십시오. 게이트 값을 0.3으로 설정하십시오.

점수가 0.3보다 낮은 세포는 표면 결합 입자 양성 세포로 간주됩니다. 배경 라벨링이 된 세포를 제거하고 내부로 유입된 특정 나노입자 또는 박테리아를 식별하려면 분석 메뉴에서 기능을 선택하십시오. 분석 메뉴를 클릭하십시오.

그런 다음 spot count 기능을 클릭하여 통계 보고서에 평균 spot count를 추가하십시오. 보고서 메뉴에서 보고서 아이콘을 클릭합니다. 이어서 통계 보고서를 정의하고, 열을 추가한 다음, 적절한 세포 집단을 선택하십시오.

확인을 클릭하십시오. 내부화 마법사가 이 보고서에 통계 데이터를 자동으로 추가하여, 모든 실험 파일의 일괄 분석에 사용할 수 있도록 데이터 파일을 템플릿 파일로 저장합니다. 파일 메뉴를 클릭하고 템플릿으로 저장을 선택하십시오.

템플릿 파일입니다. idea 소프트웨어에서 여러 데이터 파일을 분석하려면 확장자가 .AST여야 합니다. 도구(tools)를 클릭하고 일괄 데이터 파일(batch data files)을 선택한 다음 모든 RIF 파일을 입력하십시오.

해당 섹션에 보정 매트릭스 파일과 템플릿 파일을 추가하여 배치를 처리하도록 제출하고, 제출 버튼을 클릭합니다. 처리 단계가 완료되면 모든 RAF 파일이 분석되며, 각 개별 raw 파일에 대한 DAF 파일이 생성됩니다. 이후 모든 샘플의 통계가 포함된 최종 보고서가 생성되어, actin 억제 및 저온이 salmonella와 나노입자의 식세포 작용에 미치는 영향을 비교합니다.

RA W2 64.7 세포를 배지 내에서 cytochalasin D 처리 여부에 따라 37 °C에서 배양하거나, 4 °C의 배지에서 배양하였습니다. 온도 조절과 actin 조작 모두 나노입자와 salmonella의 내부화(internalization)를 감소시켰습니다. 하지만 cytochalasin D를 처리하여 세포를 배양했을 때, 표면에 나노입자가 결합된 세포의 비율은 증가한 반면, 표면에 salmonella가 결합된 세포의 비율은 감소하였습니다.

표면 결합 나노입자에 대해 양성을 보이는 세포의 비율은 37 °C에서 약 8%였으나, cytochalasin D 처리 또는 4 °C 처리 후에는 35% 이상으로 증가했습니다. 이와 대조적으로, 표면에 salmonella가 결합된 세포의 비율은 cytochalasin D 처리 후 35%에서 15%로 감소했습니다. RAW 264.7 세포를 4 °C에서 salmonella와 함께 배양했을 때, 37 °C 대조군과 비교하여 표면 결합 박테리아의 양은 뚜렷하게 증가하지 않으면서 내부화는 감소했습니다. 종합적으로, 이러한 데이터는 salmonella와 나노입자가 액틴을 필요로 하며 온도 의존적인 유사한 세포 프로세스에 의해 내부화된다는 것을 입증합니다.

또한, 데이터에 따르면 살모넬라(salmonella)가 대식세포에 지속적으로 부착되기 위해서는 액틴 중합이 필요합니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 다중분광 이미징 유세포 분석법을 통해 나노입자와 박테리아의 세포 내 internalization을 어떻게 분석하는지 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 수행할 때, 억제제는 세포 독성이 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

따라서 사용하기에 최적의 농도를 결정하기 위해 사전 세포독성 프로파일링 실험이 필요합니다. 살모넬라균을 다루는 것은 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행할 때는 적절한 개인 보호 장구를 착용하고 에어로졸 생성을 방지하는 등의 예방 조치를 준수해야 합니다.