Nanodisc 지질 입자로 ABC의 전송의 Reconstitution을위한 단계별 방법

본 실험 절차의 전반적인 목적은 A, b, C 수송체, 여기서는 수용성 막 나노디스크 입자 내로 말토스 수송체 malf GK two를 통합하는 것입니다. 이는 먼저 막 스캐폴드 단백질 MSP를 수송체 및 적정량의 지질과 함께 계면활성제 마이셀 상태에서 혼합함으로써 수행됩니다.

두 번째 단계는 폴리스티렌 비즈를 추가하고 혼합물을 하룻밤 동안 부드럽게 흔들어 주는 것이며, 이 과정에서 계면활성제가 비즈에 점진적으로 흡수되어 나노 디스크 입자가 형성됩니다. 다음으로, 침전법을 통해 비즈를 제거합니다. 마지막 단계는 젤 여과 크로마토그래피를 통해 적절하게 형성된 디스크를 응집체 및 조립되지 않은 스캐폴드 단백질로부터 분리하는 것입니다.

마지막으로, 네이티브 겔 전기영동(native gel electrophoresis) 또는 광산란 분광법(light scattering spectroscopy)을 통해 디스크의 품질을 평가합니다. 리포좀(liposomes)과 같은 다른 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 막 단백질과 디스크가 수용액에서 완전히 용해된다는 점입니다. 또한, 이제 단백질 도메인에 양방향에서 접근할 수 있습니다.

이제 막성 구획이 없으므로, 서로 다른 길이의 막 스캐폴드 단백질을 사용하여 막 단백질의 다양한 리간드 상태를 포착하고 연구할 수 있었습니다. 무엇보다 중요한 것은, 이 방법이 abc 수송체의 새로운 결합 파트너 식별과 같이 막 프로테오믹스 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있다는 점입니다. 실제로 이 기술의 영향은 치료 영역까지 확장되는데, 이는 막 단백질 및 수용체의 활성제 또는 억제제 발견을 도울 수 있기 때문입니다.

이 방법은 간단해 보이지만, 적절한 단백질 대 지질 비율을 선택할 때 주의해야 합니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 정확한 몰 비율을 계산하거나 조제물의 품질을 보장하는 적절한 대조군 실험을 수행하는 데 어려움을 겪습니다. 따라서 이 방법의 시각적 시연은 새로운 학생들이 다양한 단계와 잠재적인 문제점을 학습하는 데 매우 유용합니다.

플라스미드 P MSSP 1D one을 이용하여 e coli strain BL 21 DE three에서 hexa histidine tagged MSP를 배양하기 시작합니다. 600 nanometers에서의 흡광도(optical density)가 약 0.5일 때 단백질 생산을 유도하고, 37 degrees Celsius에서 3시간 동안 배양한 후, 4 degrees Celsius에서 5,000 Gs로 10분간 원심분리하여 세포를 수확합니다. 100 micromolar PMSF가 포함된 TSG 10 버퍼에 펠릿을 재현탁합니다. French press를 사용하여 8,000 PS.I에서 세 번 세포를 파쇄합니다. 4 degrees Celsius에서 5,000 Gs로 10분간 원심분리하여 불용성 물질을 제거합니다. 그 후 125,000 Gs에서 45분간 초원심분리하여 MSP가 포함된 가용성 분획을 분리합니다.

TSG 10 버퍼에 담긴 약 1.5 milliliters의 nickel seros high performance를 사용하여 니켈 킬레이트 크로마토그래피로 MSP를 정제하십시오. 50 millimolar ILE elute가 포함된 T SG 10 버퍼로 오염 물질을 세척하십시오. 투석 후, 600 millimolar I midaz가 포함된 TSG 10 버퍼로 MSP를 용리하십시오.

TSG 10 버퍼 MSP 내의 정제된 단백질은 -70°C에서 약 10~15 mg/mL의 단백질 농도로 보관할 수 있습니다. MAL K의 C-말단에 His-tag이 붙은 MALF GK 2 복합체는 플라스미드 pED 22 FG K로부터 발현됩니다. E. coli BL21(DE3) 균주에서 배양하여 600 nm에서의 측정 광학 밀도가 약 0.5가 되었을 때 0.2% L-Arabinose를 첨가하여 37°C에서 3시간 동안 단백질 생산을 유도한 후, 세포 용해 및 원심분리를 수행합니다.

이전과 마찬가지로, 멤브레인 펠릿을 TSG 20 버퍼에 현탁하여 최종 농도를 5 mg/mL로 맞춥니다. 다음으로, 1% (w/v) GDM을 사용하여 4 °C에서 3시간 동안 부드럽게 흔들어주며 물질을 가용화합니다. MAL FTK 2의 정제 과정과 동일하게 초원심분리를 통해 불용성 물질을 제거합니다.

그 후 용해된 mal FTK two 복합체가 포함된 상층액을 수집하고 니켈 킬레이트 크로마토그래피로 다시 정제합니다. SUEx 200, HR ten three hundred 컬럼을 사용하여 0.5 milliliters per minute의 유속으로 TSGD 버퍼 내에서 젤 여과 크로마토그래피를 통해 복합체를 추가로 정제합니다. 인지질을 준비하기 위해, 클로로포름에 용해된 e coli 총 지질 추출물을 스크류 캡 마이크로 튜브에 1000 anomal 분량으로 나누어 담고, 완만한 질소 기류 하에서 용매를 증발시킨 후 진공 상태에서 하룻밤 동안 추가로 건조합니다.

다음으로 건조한 후, 최종 농도가 5 NMO가 되도록 TS 버퍼에 지질 막을 녹이고 강하게 볼텍싱한 뒤, 약 5초 동안 5회 펄스 초음파 처리합니다. 용해된 지질은 수성 TS 버퍼에 일반적으로 불용성이기 때문에 약간 불투명하게 보일 수 있으나, 현탁 상태를 유지해야 합니다. DDM을 최종 농도 0.5%가 되도록 첨가합니다. 이 시점에서 용액이 투명해집니다. 지질 혼합물을 항온 수조에 넣고 약 5초 동안 5회 펄스 초음파 처리합니다.

지질 혼합물은 4°C에서 최대 일주일 동안 보관할 수 있습니다. Bio-beads를 준비하려면 50mL 튜브에 약 10~15mL의 bio-beads를 넣으십시오. 먼저, 100% methanol 50mL로 비즈를 세척합니다.

비즈가 중력에 의해 가라앉을 때까지 기다린 후 용액을 조심스럽게 따라냅니다. 이 과정을 메탄올에 대해 한 번, 그 다음 95%Ethanol, milli Q water, 그리고 마지막으로 TS buffer에 대해 각각 두 번씩 반복합니다. MSP를 TSGD buffer에 희석하여 최종 농도가 약 7 mg/mL 또는 0.3 mM이 되도록 하여 나노 불연속 구조 형성을 시작합니다.

성공적인 실험을 위해서는 혼합할 지질과 단백질의 정확한 비율을 선택하는 것이 중요합니다. TSGD 버퍼를 사용하여 단백질:MSP:지질 비율을 1:3:60으로 하여 정제된 malf GK2 복합체 약 2 µM을 최종 부피 300 µL가 되도록 혼합하십시오. 여기서는 음성 대조군으로서 지질 과량 비율인 1:3:400의 샘플도 함께 준비합니다. 튜브에 bio-bead 현탁액 50 µL를 넣고, 4 °C의 rocking table에서 하룻밤 동안 혼합물을 배양하십시오. 다음 날, 중력을 이용하여 비드를 침전시킵니다. 비드가 가라앉으면 narrow tip을 사용하여 bio-beads가 최대한 포함되지 않도록 용액을 파이펫으로 옮깁니다.

100,000 GS에서 20분간 초원심분리를 하여 커다란 침전물을 제거합니다. 이전에 TSG 10 버퍼로 수행한 것과 같이 겔 여과 크로마토그래피를 통해 디스크를 정제하십시오. 다음으로, 준비물의 안정성을 테스트하기 위해 동일한 겔 여과 컬럼에 Eloqua를 주입합니다.

그 다음 디스크가 포함된 분획들을 모읍니다. 준비된 시료의 품질은 네이티브 젤 전기영동으로 평가합니다. 재구성 품질을 평가하기 위해 1 µM의 나노 디스크를 분석합니다.

또한 나노디스크(nano discs)로 재구성된 mal ftk two 복합체에 대한 mal E의 결합을 평가하십시오. 전기영동 후, 겔을 kumasi blue로 10분 동안 염색하고 약 1시간 동안 탈색하십시오. 동적 광산란법(dynamic light scattering) 또는 DLS를 수행하려면, 이전과 같이 0.1 milliliters per minute의 유속으로 SUEx 200 HR ten three hundred 컬럼을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피로 나노디스크를 먼저 정제하십시오.

나노 디스크가 포함된 분획들을 모으고, AmCon 원심 여과 장치를 사용하여 약 10 mg/mL로 농축합니다. 그 후 샘플을 두 번 여과합니다. 1 µL 내부 부피의 쿼츠 큐벳을 사용하여 dynapro nano star 장비로 DLS 분석을 수행합니다.

동적 소프트웨어를 사용하여 입자의 직경과 분자량을 추정한 후, 콜로리메트릭 분석법(colorimetric assay)을 통해 재구성된 mal FTK two 나노디스크의 ATPase 활성을 결정합니다. 먼저 1 $\mu$M의 정제된 디스크와 1 mM의 ATP를 말레온산(mal e)의 양을 점차 늘려가며 혼합합니다. 시료를 37 °C에서 20분 동안 배양합니다.

그런 다음 660 nanometers에서 무기 인산의 방출량을 측정합니다. 방출된 인산의 양을 인 표준 용액으로 작성한 표준 곡선과 비교합니다. 나노 디스크는 겔 여과 크로마토그래피로 정제합니다.

크로마토그램을 통해 재구성된 디스크의 대부분이 단일 피크로 용출되는 것을 확인할 수 있는 반면, 과량의 지질로 제작된 디스크는 void volume에서 용출되며 일련의 넓은 피크로 나타납니다. 디스크 조제의 품질은 native gel electrophoresis를 통해 추가로 분석하며, 제한된 양의 지질로 재구성된 디스크는 native gel 상에서 날카로운 밴드 형태로 이동하는 반면, 과량의 지질 존재 하에 재구성된 디스크는 스미어(smear) 형태로 이동합니다. DLS 분석 결과, 디스크 집단은 평균 반경 5.0 nanometers로 균일함을 보입니다. DLS 근사치에 기반하면 재구성된 디스크의 겉보기 분자량은 215 kilodaltons입니다. 과량의 지질 존재 하에 재구성된 샘플은 비균질 샘플의 전형적인 특징인 100 nanometers 부근의 넓게 분포된 반경을 나타냅니다.

MAL FTK 2 복합체의 활성은 TP 가수분해 속도와 말토스 결합 단백질인 MAL E와 같은 상호작용 파트너에 대한 친화력을 측정하여 평가합니다. 비변성 겔 전기영동을 사용하여 MAL E가 MAL FTK 2 수송체와 높은 친화력으로 결합함을 확인하였습니다. MAL E와 MAL FTK 2 사이의 복합체 형성을 검출할 수 있으며, 여기에서는 MAL E 농도에 따른 MAL KA TPA 활성의 촉진 정도를 보여줍니다.

나노 디스크의 제작은 비교적 간단하지만, 최적 조건에서 조금만 벗어나도 단백질의 가역적이지 않은 응집으로 이어질 수 있으며, 일단 숙달되면 이 기술은 이틀 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때, 적절한 단백질-지질 비율을 선택하는 것이 중요하다는 점을 기억해야 합니다. 지질의 양이 과도하면 다분산된 커다란 리포좀 유사 입자가 생성되기 때문입니다. 따라서 겔 여과 외에도 광산란 분광법, 분석용 초원심분리법 또는 더 간단하게는 네이티브 겔 전기영동과 같은 기술을 사용하여 재구성된 물질의 품질을 세밀하게 분석하는 것이 매우 중요합니다.

디스크에 포함되는 인지질의 종류와 막 스캐폴드 단백질의 종류가 재구성 효율에 영향을 줄 수 있음을 기억하십시오. 이 영상을 통해 원하는 막 단백질을 포함하는 가용성 및 균질한 나노디스크를 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하셨기를 바랍니다. 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.