Orthotopic 폐 이식의 Murine 모델에 Obliterative Bronchiolitis의 개발

이 프로시저의 전반적인 목표는 정위성 폐 이식을 모방하여 세기관지염 반복 모델을 구축하는 것입니다. 이는 먼저 C 57 BL 10 마우스로부터 공여 폐를 적출함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 문합을 위해 기관지, 폐동맥 및 폐정맥의 커프를 준비하는 것입니다.

다음으로, 준비된 공여 폐를 수용자 C57BL/6 마우스에 이식합니다. 마지막 단계는 이식 후 21일 또는 28일 동안 이식된 마우스를 관찰하는 것입니다. 최종적으로, 조직학적 분석을 통해 이식된 폐에서 세기관지염 병변을 확인합니다.

거울상 이종 기도 이식 모델과 비교하여 이 모델의 주요 장점은 현재 모델이 인간의 상태를 모방한다는 점입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 어려움을 겪을 수 있는데, 이는 생쥐의 상부 구조가 매우 섬세하고 체중이 쥐의 10분의 1에 불과하여 손상에 더 취약하기 때문입니다. 공여 생쥐를 밀폐된 유지 챔버에 넣고 5% isof fluorine으로 마취를 유도하십시오. 다음으로, 20 gauge 정맥 카테터를 사용하여 생쥐의 기관을 삽관한 후, 설치류 전용 인공호흡기에 연결하십시오.

1~2% isof fluorine로 마취 상태를 유지합니다. 꼬리 튕기기와 발가락 꼬집기에 반응이 없어 마우스가 완전히 마취되었음을 확인한 후, 마우스를 앙와위로 눕히고 복부를 70% alcohol로 소독합니다. 이제 가위로 복부 위의 피부를 절개하여 복근을 노출시킵니다.

다음으로, 먼저 복벽을 따라 정중 절개를 한 후 흉골을 가로 방향으로 절개하여 복부 정중 절개 및 흉골 절개술을 수행합니다. 장을 옆으로 밀어내고 간 바로 아래에 위치한 하대정맥(inferior vena cava)을 찾습니다. 하대정맥에 kg당 100 µL의 헤파린을 주입합니다. 이어서 간의 낫인대(falciform ligament)를 아래로 당기고, 횡격막의 복측 꼬리쪽 부착 부위를 따라 척추 방향으로 절개합니다.

흉강을 노출시키기 위해 흉벽의 양측을 목 부분까지 절개합니다. 폐를 보호하면서 늑골을 양측으로 절단하고 흉선을 제거합니다. 다음으로, 횡격막 높이에서 흉강 내 하대정맥(IVC)을 절단합니다.

이제 심장을 찾아 우심방이(right atrial appendage)를 절제합니다. 그런 다음 폐동맥간 뿌리 부분에 횡단 절개를 가하고, 이 절개 부위를 통해 2 mL의 냉각 젖산 링거액과 0.1 mL의 헤파린으로 폐를 세척합니다. 기관을 노출시킨 후 식도와 함께 절단하여 제거합니다.

이제 호기말 팽창의 3분의 2 지점에서 환기를 중단하십시오. 심장 폐 블록을 절제하여 얼음 위에 보관하십시오. 절제된 폐를 빛으로부터 보호하기 위해 거즈를 덮으십시오.

폐정맥(pv)까지 폐인대를 절개합니다. 폐문을 국소화하기 위해 식도와 대동맥을 제거합니다. 폐문의 가장 앞쪽(cranial aspect)에 위치한 폐동맥(pa)과 이에 부착된 주기관지를 찾습니다.

기관지로부터 폐동맥을 조심스럽게 박리합니다. 이제 24게이지 IV 카테터를 길이 0.5 mm, 연장 길이 0.7 mm로 절단하여 PA 커프를 제작합니다. 커프의 표면은 AB braided 처리되어 있습니다.

문합을 위한 표면을 제공하기 위해, PA 커프와 유사한 재료를 사용하여 기관지용 커프를 제작하되, 길이 1 mm에 연장 길이 0.7 mm로 절단한 20 gauge 카테터만을 사용합니다. PV 커프의 크기는 공여 마우스의 체중에 따라 달라집니다. 체중이 24~27 g인 마우스의 경우입니다.

체중 27~32g의 마우스의 경우, 커프 크기는 22 gauge이며 길이는 0.7 millimeter, 확장 길이는 0.7 millimeter입니다. 길이는 동일하나, 20 gauge 카테터를 사용합니다. 이제 폐동맥, 폐정맥 및 기관지의 원위부 끝에 커프를 삽입하고, 각각을 9-0 silk suture로 고정하십시오.

모든 커프가 적절하게 부착된 후, 준비된 공여자 폐를 젖산 링거액(lactated ringers)에 적신 거즈로 감싸고 이식 전까지 얼음에 보관하십시오. 수혜자 마우스의 준비를 위해, 공여자에게 적용했던 것과 동일한 방식으로 마취를 유도하고 기계 환기를 실시하십시오.

왼쪽 흉벽을 면도하고 70% 알코올로 소독합니다. 왼쪽 세 번째 늑간 공간에 흉곽 절개술 절개를 하여 시작합니다. 절개선을 척추 가까이 등쪽으로 확장합니다.

수술 부위가 무균적으로 드레이핑되었는지 확인하고, 심장 인접 부위의 왼쪽 폐혈관과 기관지에 미세 혈관 클램프를 배치합니다. 폐동맥은 두측(cranial aspect)에서, 폐정맥은 폐문(hilum)의 꼬리쪽(caudal end)에서 관찰할 수 있으며, 기관지는 그 사이에 위치합니다. 다음으로, 지혈집게(hemostat)를 이용해 부드럽게 견인하여 PA, PV 및 기관지에 가벼운 장력을 가합니다.

폐문 구조물은 클램프로 고정한 상태로 유지하고 왼쪽 폐를 조심스럽게 절제합니다. 폐동맥, 폐정맥 및 기관지를 분리한 다음, 각 구조물 주변에 봉합사를 느슨하게 겁니다. 폐동맥(PA)을 외막 초에서 완전히 박리한 후, 전벽에 혈관 둘레의 약 4분의 1 정도 되는 작은 횡절개를 가합니다.

동맥의 배측 부분의 연속성을 유지한 상태에서, 차가운 젖산 링거액(lactated ringers)에 적신 면 거즈로 감싼 공여자 폐를 꺼내 흉강 내에 배치합니다. 다음으로, 문합을 위해 수혜자의 pa, PV 및 기관지에 커프를 삽입하고 나노 봉합사(nano suture)로 결찰합니다. 그다음, 수혜자의 폐를 제거합니다.

그 후 폐문 교차 클램프를 제거하여 재관류와 환기가 이루어지도록 합니다. 이식된 폐를 수혜 동물의 흉강 내에 다시 배치하고, 5-0 봉합사를 사용하여 흉강 절개 부위를 봉합합니다. 이제 마우스가 마취에서 회복되어야 합니다. 마우스가 의식을 회복한 후 통증 완화를 위해 부프레노르핀을 투여할 수 있습니다.

이 표는 급성 거부반응의 조직학적 점수와 폐포성 세기관지염(OB)의 유병률을 보여줍니다. 이식 후 급성 거부반응 점수를 A 점수라고 합니다. 동종이식 조합은 ISO 이식편과 비교했을 때 급성 또는 만성 거부반응 병리가 상당히 더 많이 나타납니다. 또한, 이식 후 21일과 28일째에 폐포성 세기관지염의 유병률이 ISO 이식편보다 동종이식 조합에서 유의하게 더 높았습니다.

폐 이식 후 28일째의 육안적 소견과 조직병리학적 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 이 이미지들은 육안적 소견과 H&E 염색된 ISO 이식 폐 및 우측 정상 폐를 나타냅니다. 또한, BL6 수용마우스에 이식되어 각각 OB와 non-OB가 발병한 BL10 폐 동종이식편의 H&E 및 Masson's trichrome 염색 이미지가 제시되어 있습니다.

하나의 B에서 흰색 화살표는 OB 병변을 식별합니다. 이 패널은 BL 6 폐 동종 이식을 받은 BL 10 마우스 수혜체를 보여줍니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 적절히 수행될 경우 거의 30분 이내에 완료될 수 있습니다.

이 기술의 유용성은 폐 이식 후 발생하는 일차성 이식편 기능부전, 급성 거부반응 및 소실성 세기관지염에 관한 기전적 질문을 해결하는 데 활용될 수 있다는 점에 있습니다.