탄소 고정 가능성 화학 층상 남극 호수 및 평가에서 미생물 진핵 농축 문화의 확립

본 절차의 전반적인 목표는 남극 보니 호수(Lake Bonnie)에서 원생생물 농축 배양물을 생산하고, 대사 다양성의 초기 대리 지표의 일부로서 탄소 고정량을 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 보니 호수에서 원생생물과 식물성 플랑크톤의 정점이 확인된 수심의 호수물을 채취합니다. 그 다음, 채취한 호수물 시료를 다양한 성장 배지에 접종하고 온도 조절기 및 조명이 설치된 성장 챔버에서 4~6주 동안 배양합니다.

배양물은 필요에 따라 4 °C에서 운송할 수 있습니다. 다음 단계는 농축 배양물에서 조세포 용해물을 추출하는 것입니다. 이 절차의 마지막 단계는 ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase(Rubisco) 활성에 대한 방사성 동위원소 분석법을 사용하여 세포 용해물의 탄소 고정 잠재력을 평가하는 것입니다.

결과적으로, 원생생물 농축 배양은 자연 원생생물 군집의 탄소 고정 잠재력의 변동성을 보여줍니다. 이 방법은 호수 미생물 생태학에 관한 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 성층화된 남극 호수의 다양한 단계에서 탄소 순환 내 미생물 진핵생물의 역할 등이 이에 해당합니다.

후속 세대의 농축 배양을 위한 수층 샘플링은 자주 사용되는 기술이지만, 이 방법은 예측하지 못한 합병증이 발생할 수 있는 극저온 환경에서 작동하도록 수정되었습니다. 저는 처음 천연 호수 샘플에서 Redisco 분석법을 테스트할 방법을 고민하던 중 이 방법 아이디어를 얻었습니다. 샘플링 지점이 많은 연구자들에게 생소한 환경에 위치하여 샘플링 단계들을 상상하기 어렵기 때문에, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.

남극 McMurdo dry valleys에 위치한 수많은 영구 빙하 호수 중 하나인 Lake Bonnie에서 샘플을 수집합니다. 수층 샘플링 하루 전에 샘플링 지점을 선택하고 준비하십시오. 이를 통해 시추 및 빙하 구멍 융해로 인한 교란 후 수층의 층상 구조가 다시 형성될 수 있습니다. 수층에 접근하기 위해 GPS로 시추 지점의 위치를 확인하십시오.

먼저 4인치 Jiffy 플라이트 연장관 및 커팅 비트가 장착된 Jiffy Ice 오거를 사용하여 얼음에 구멍을 뚫습니다. 이는 구멍 내에서 드릴이 어는 것을 방지하기 위함입니다. 수면 위 약 4~6인치 지점에서 드릴 작업을 중단하여 액체 상태의 물까지 뚫지 않도록 주의하십시오. 시료 채취를 위해 드릴 구멍의 직경을 6인치에서 2피트까지 확장해야 합니다.

이는 가열된 폴리에틸렌 글리콜을 구리 파이프 홀을 통해 순환시키는 열해 모델 홀 멜터를 사용하여 수행됩니다. 융해 작업은 일반적으로 수층 시료 채취 전날 최대 18시간 동안 진행됩니다. 필요한 모든 장비와 시료 보관 용기가 시료 채취 현장에 준비되었는지 확인하십시오.

시료 채취 재료에는 5~10L 용량의 NICU 병, 수심 측정 케이블이 달린 윈치, 각 채취 수심별로 충분한 수의 시료 병, 메신저 및 시료 운반용 냉장 박스가 포함됩니다. 호수 물 여과 작업이 채취 당일에 완료되어야 하므로, 오전 5시경 이른 시간에 채취를 시작하십시오. 보정된 수동 윈치에 연결된 kin 샘플러를 사용합니다.

본 연구를 위해 원하는 깊이에서 1~5L의 수중 샘플을 채취하십시오. 샘플링 깊이는 아이스 홀의 PI 대칭 수위로부터 측정한 6m, 15m 및 18m입니다. 호수 샘플을 쿨러에 보관하고 샘플 채취 지점에서 현장 실험실로 운송하십시오.

ATV에 장착된 썰매를 사용하여 시료를 채취한 후, 현장 실험실에서 처리 또는 안정화해야 합니다. 시료를 현장 실험실로 운반한 즉시 농축 배양을 시작해야 합니다. 0.5~1L의 호수물을 47mm, 0.45µm 공극 크기의 필터로 농축하십시오.

부드러운 여과 방식을 사용하여 POLYETHERS 설폰 필터로 여과합니다. 자연 군집의 다양성을 확인하고자 하는 경우, 두 번째 샘플을 47 mm, 0.45 micron 공극 크기의 필터로 여과하십시오.

폴리에테르설폰(POLYETHERS sulfone) 필터를 액체 질소에 넣어 급속 냉동합니다. 각 필터를 필터링된 호수물 약 20 milliliters가 담긴 50 milliliter 멸균 팔콘 튜브로 옮깁니다. 호수물은 필터와 동일한 샘플링 깊이에서 채취한 것이어야 합니다.

각기 다른 배양 배지를 사용하여 증식시키기 위해 세포 현탁액을 25 cm 정사각형 멸균 세포 배양 플라스크로 옮깁니다. 각 시료 채취 깊이별로 여러 개의 반복구를 설정합니다. 각 배양 플라스크에 Bold Basil 배지, BG 11 및 F two의 멸균 용액을 각각 50 x씩 첨가합니다.

혼합 영양 부족 생물의 배양이 필요한 경우, 보충제가 첨가된 F two 용기 두 개를 준비하고, 그 중 하나의 배양 플라스크에 멸균된 쌀알 2~3알을 넣습니다. 미국 실험실로 운송하기 전, 온도 조절 성장 인큐베이터에서 저온 및 저광도 조건으로 최소 4주 동안 배양합니다. 농축 배양물을 멸균된 50 milliliter Falcon 튜브로 옮깁니다. 운송 요청서에 '냉동 금지 및 냉장 보관'이라는 운송 요구 사항을 기재하십시오. 미국 도착 후, 각 농축 배양물 5 milliliters를 125 milliliter 플라스크에 담긴 45 milliliters의 적절한 성장 배지로 옮깁니다.

멸균된 스펀지로 캡을 씌운 멸균 Erlenmeyer 플라스크를 사용합니다. 4°C의 온도 제어 환경 성장 챔버에서 농축 배양액을 정지 배양 상태로 유지하며, 30일마다 신선한 배지로 계대 배양을 수행합니다. 세포 용해물 추출 절차를 시작하려면, 완만한 진공 상태에서 5L의 농축 배양액을 25mm Whatman GF/F 필터로 여과합니다.

다음으로, 멸균된 강철 가위로 필터를 4~5개 구역으로 자릅니다. 그런 다음 멸균된 핀셋을 사용하여 자른 조각들을 0.1 mm 직경의 2 mL 스크류 캡 튜브에 옮깁니다. 튜브의 5분의 1 정도까지 채웁니다.

지르코니아 실리카 비드. 튜브에 필터 추출 버퍼 1.25 milliliters를 넣은 다음, 미니 비드 비터를 사용하여 속도 설정 48에서 30초 동안 세포를 파쇄하고 1분간 얼음에 보관하십시오. 샘플의 가열을 방지하기 위해, 비드 파쇄와 1분간의 얼음 배양을 교대로 반복하여 비드 파쇄 과정을 두 번 더 수행한 후 원심분리하십시오.

4°C에서 3000 ×g로 2분 동안 슬러리를 원심분리하십시오. GFF 필터 섬유와 세포벽 잔해로 구성된 느슨한 펠릿이 형성됩니다. 상청액 200 µL를 취하여 얼음처럼 차가운 90% acetone 800 µL에 담그십시오.

남은 상청액을 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 분광광도계를 사용하여 664 nanometers 및 647 nanometers 파장에서 추출 가능한 엽록소 A를 측정합니다. 남은 상청액을 4°C에서 15,000 ×g로 2분 동안 원심분리합니다.

불용성 세포막 펠렛과 남아있는 GFF 필터 섬유가 섞이지 않도록 주의하며 S를 깨끗한 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 이 수용성 세포 용해물은 다음에 시연할 루비스 카르복실라아제 활성 측정법에 사용할 수 있습니다. 분석을 시작하려면 각 수용성 용해물 125 microliters를 얼음 위에서 냉각시킨 1.5 스크류 캡 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.

음성 대조군 샘플의 경우, 1.5 mL 스크류 캡 마이크로 원심분리 튜브에 가용성 용해물을 125 µL 첨가하되, 기질은 첨가하지 않습니다. 이후 모든 샘플과 음성 대조군에 대해 중복 반응을 수행합니다. 분석 버퍼 10 mL를 새로 준비하여 얼음 위에 놓고 냉각시킵니다.

모든 시료와 음성 대조군에 사용할 충분한 양의 분석 버퍼를 5 mL 튜브에 분주합니다. 이후의 모든 단계는 흄 후드 내에서 수행해야 합니다. 정해진 분량의 버퍼에 C 14 표지 소듐 바이카보네이트를 첨가하고 버퍼를 얼음 위에 보관합니다.

C 14가 포함된 분석 버퍼 10 µL를 취해 분석 버퍼 1 mL에 희석하고 뒤집어서 섞습니다. 희석된 혼합물 100 µL를 신틸레이션 바이알에 담긴 bios safe two 신틸레이션 카운팅 칵테일 3 mL에 넣고 뒤집어서 혼합합니다. Beckman LS 6, 500 카운터로 C 14 카운트를 측정하며, 분석을 계속하기 전에 신틸레이션 카운트가 18, 000 counts per minute 이상이어야 합니다.

어세이 버퍼에 C 14 표지 소듐 바이카보네이트를 충분히 첨가한 후, 반응 튜브를 25 °C로 설정된 드라이 배스로 옮겨 3~5분 동안 인큐베이션합니다. 다음으로, 용해물에 100 µL의 어세이 버퍼를 첨가하고 25 °C에서 5분 동안 인큐베이션합니다. 5분 후, 각 샘플에 리불로스 이인산(ribulose bisphosphate)을 첨가하고 25 °C에서 5~10분 동안 반응을 진행시킵니다.

반응을 중단하려면 100% probiotic acid 100 µL를 첨가하고, 결합되지 않은 C 14를 제거하기 위해 2000 ×g에서 1시간 동안 원심분리합니다. 마지막으로, 샘플의 전체 부피를 Bios Safe Two 신틸레이션 카운팅 칵테일 3 mL가 들어 있는 신틸레이션 바이알로 옮겨 acid stable의 분당 계수(counts per minute)를 측정합니다.

신틸레이션 계수를 통해 최종 생성물을 측정하였습니다. 남극 보니 호수의 세 가지 깊이에서 새로운 저온 적응형 광영양 및 혼합 영양 원생생물을 분리하기 위해 농축 배양법을 사용하였습니다. 더 다양한 유기체를 선택하기 위해 BOLD, BBMF 2, 해양 배지 및 BG 11 배지 등 다양한 유형의 성장 배지를 사용하였습니다.

이 표에 표시된 영양분 농도와 광합성 유효 방사선(PAR)은 시료 수집 당시의 조건을 나타냅니다. 광학 현미경을 통한 배양액의 육안 관찰 결과, 대부분의 세포에서 엽록소 색소가 확인되어 광영양성 원생생물이 우점하고 있음이 밝혀졌습니다. 또한, 배양액은 접종원이 채취된 시료 채취 깊이와 배양에 사용된 배지의 종류에 따라 다양한 세포 형태를 나타냈습니다.

탄소 고정의 대리 지표로서 rubis 효소에 의해 촉매되는 carboxylase 활성의 최대 속도를 농축 배양액에서 측정하였습니다. 여기에 표시된 바와 같이, 광영양 원생생물 바이오매스의 추정치로서 잠재적 chlorophyll a 함량 또한 모니터링하였습니다.

모든 배양액을 동일한 온도와 광 조건에서 배양했음에도 불구하고, 탄소 고정 잠재력과 광영양 생물량은 농축 배양액마다 크게 달랐습니다. 최대 rubis O 활성은 BBM 배지에서 성장한 농축 배양액 4 및 6과 BG 11 배지에서 성장한 농축 배양액 13 및 14에서 관찰되었습니다. 반면, F two 성장 배지에서 농축된 배양액 1921 및 23은 최대 카르복실화 효소 활성이 4배에서 34배 더 낮게 나타났습니다.

카르복실화효소 활성이 엽록소 a 기준으로 표시되었으므로, 이러한 차이는 F2 배양액의 낮은 생물량 수준 때문이 아니었습니다. 또한, 피어슨 상관 분석 결과 rubis co 활성은 엽록소 a 농도와 상관관계가 없는 것으로 나타났습니다. 6m와 15m 깊이의 호수물로 접종한 BBM 배양액입니다.

Enrichment 5번 포럼에서 엽록소 A 수치가 가장 높게 나타난 반면, 다른 모든 배양물에서는 rubis 효소 활성도와 관계없이 엽록소 a 수치가 상대적으로 낮게 나타났습니다. 숙련된 경우, 호수 시료 채취 기술을 수행하는 데 약 2시간이 소요됩니다. 채취하는 시료의 수에 따라 다르지만, carboxylase 분석 또한 적절히 수행되었을 때 2시간이 소요됩니다. 이 절차를 마친 후에는 종속영양 효소 활성 분석과 같은 다른 방법을 사용하여 종속영양생물이 어느 깊이에서 발생하는지와 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 이제 이 영상을 시청함으로써 호수 시료를 채취하고, 이를 농축하며, rubis carboxylase 활성을 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다.