의 정의 Aspergillus 니제르 형태론

이 방법은 사상균인 Aspergillus niger의 미세입자 의존적 형태 구조를 생성하고 분석하여 균류의 형태와 생산성의 상관관계를 규명합니다. 3리터 교반 탱크 생물 반응기에서 미세입자 유무에 따라 Aspergillus niger를 72시간 동안 배양하여 비생산성을 계산합니다. 정해진 시간 지점에 샘플을 채취하여 바이오매스 건조 중량과 β-fructosidase 활성을 측정합니다.

72시간 후, 현미경으로 진균의 형태를 관찰하고 디지털 이미지 분석을 통해 특성을 규명합니다. 그런 다음 이미지 분석의 관련 파라미터들을 결합하여 특정 생산성과 수학적으로 상관관계가 있는 형태 지수(morphology number)를 산출합니다. 궁극적으로 이 방법은 aspergillus Niger의 형태를 정밀하게 생성하고 포괄적으로 특성화함으로써 사상성 미생물의 형태 형성 과정에 대한 더 깊은 이해를 가능하게 합니다.

Aspergillus niger는 수십 년 동안 생명공학 분야에서 중요한 산업적 유용 균주로 활용되어 왔습니다. Aspergillus niger 및 관련 종들의 가장 흥미로우면서도 종종 제어가 어려운 특성 중 하나는 배양 조건에 따라 조밀한 구형 펠릿부터 점성 균사체까지 다양하게 나타나는 복잡한 형태학적 특성입니다. 본 절차의 주요 장점은 미세 입자를 첨가함으로써 공정 요구 사항에 맞춰 진균의 형태를 구체적으로 맞춤 제작할 수 있다는 점입니다.

지금까지 진균 형태의 이러한 맞춤화에 대해 설명된 다른 방법은 없었습니다. 이 방법은 사상성 미생물의 배양에 관한 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 산업적 응용을 위해서는 진균 형태를 제어하는 것뿐만 아니라, 생산성이 좋은 진균 형태와 낮은 진균 형태를 구분하는 것이 매우 중요하기 때문입니다.

본 프로토콜은 진균 형태의 바람직한 맞춤 설정 및 특성 분석을 위한 수단을 제공합니다. 이 방법은 aspergillus Nigel 형태에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, penicillium 또는 strepto 균주와 같은 다른 사상성 미생물에도 적용 가능합니다. 동봉된 프로토콜에 상세히 기술된 대로 멸균 배양을 위한 4개의 바이오리액터를 설정하십시오.

미세입자 첨가에 기반하여 서로 다른 형태의 Aspergillus niger를 배양합니다. 72시간 후 배양액 샘플 50 milliliters를 Falcon 튜브로 옮깁니다.

바이오매스 시료는 데시케이터에서 건조 후 최소 두 번 이상 중복으로 채취하며, 마이크로저울을 사용하여 셀룰로오스 필터의 무게를 잽니다. 워터젯 진공 펌프가 연결된 뷰히너 깔때기에 필터를 배치하고, 10 mL의 시료를 여과한 다음 10 mL의 탈이온수를 흘려 바이오매스에서 배지 성분을 제거합니다. 필터의 중앙 부분을 한 번 접습니다.

이를 유리 페트리 접시에 담아 항량에 도달할 때까지 건조기에 넣습니다. 필터를 데시케이터로 옮겨 식힙니다. 그 다음 무게를 측정합니다.

글루코스 산화효소 및 과산화효소 효소 분석을 위해 무게 측정, 필터 간 무게 차이 계산 및 이후 시료 부피로 나누는 계산 과정을 통해 리터당 바이오매스 건조 중량을 산출합니다. 1.5 milliliters 시린지 패스를 사용하여 시료를 얼음 위에 보관합니다. 셀룰로오스 아세테이트 필터를 통해 배양액 현탁액을 반응 튜브로 여과하여 beta fructo SASE 분석을 수행합니다.

통계적 견고함을 위해 두 개의 3반복 시료를 사용하여 세밀하게 성공 여부를 확인합니다. 분석을 시작하려면 시험관에 20 µL의 시료를 첨가하십시오. pH 및 온도에 따른 수크로오스의 글루코스 분해를 제어하려면 20 µL의 시료 대신 20 µL의 탈이온수를 사용하십시오. 또한, 각 시료에 대해 분석을 통해 배양액 내 잔류 글루코스에 대한 음성 대조군을 준비하십시오.

열 불활성화된 시료 20 µL를 준비합니다. 수크로스에서 글루코스로의 반응을 개시하기 위해, pH 5.4인 1.65 M 수크로스 용액 200 µL를 시료 20 µL에 첨가합니다. 모든 반응 튜브를 40 °C 가열 블록에서 20분 동안 배양합니다. 튜브를 얼음 위에서 냉각시킨 후, 95 °C에서 10분 동안 가열하여 반응을 정지시킵니다.

필요 시 샘플을 원심분리하고, 측정된 흡광도가 보정 값 범위 내에 있도록 분석용 샘플을 희석합니다. 이제 각 반응에 대해 마이크로타이터 플레이트에 샘플 2 µL를 넣습니다. 샘플 측정은 3회 반복 실시합니다.

또한 1 mM에서 15 mM 범위의 포도당 용액 10종으로 표준 곡선을 준비하십시오. 영점 교정을 위해서는 2 µL의 탈이온수를 사용하십시오. 다음으로, 각각에 200 µL의 시약 용액을 첨가하십시오.

실온에서 10분 동안 배양합니다. 96-well sunrise 마이크로플레이트 리더기와 Magellan 데이터 회수 소프트웨어를 사용하여 450 nanometers에서 흡광도를 측정합니다. 스프레드시트로 결과 차트를 열고 표준 곡선 검량선을 작성합니다.

각 시료의 활성을 계산하십시오. 그 다음, 시료 활성에서 적절한 음성 대조군의 값을 빼서 beta fructosidase 활성을 산출하십시오. 마지막으로, 바이오매스 건조 중량과 beta fructosidase 활성을 고려하여 비생산성을 계산하십시오.

3 mL의 배양 현탁액을 플라스틱 페트리 접시에 넣고 생리식염수로 희석하여 형태학적 구조를 분리합니다. 현미경 사진의 품질은 매우 중요합니다. 이후의 이미지 분석을 위해 희석 단계에서 주의를 기울여야 합니다.

카메라가 내장된 현미경 아래에 페트리 접시를 배치합니다. 각 이미지에 최소 하나의 객체가 완전히 포함되도록 하여, 샘플당 형태학적 구조 이미지 약 100장을 획득하고 저장합니다. 서로 다른 반응기의 샘플이 담긴 접시들에 대해서도 동일한 방식으로 진행하며, 매번 새로운 이미지를 획득합니다.

추가된 탈크 분말의 양이 서로 다른 여러 반응기에서 배양된 시료들의 서로 다른 형태학적 성장 형태를 확인하십시오. 그런 다음 이미지 처리 프로그램인 Image J에서 동일한 시료의 모든 이미지를 엽니다. 프로세스 도구(process tool)를 사용하여 이진화(binary) 처리하십시오.

일련의 이미지 전체에 명령을 적용하기 위해 이미지를 흑백으로 변환합니다. 다음으로 매크로 코드를 사용하여 스케일 바가 포함된 사진 중 하나를 엽니다. 스케일 바를 가로지르는 직선을 그려 2000 microns에 해당하는 픽셀 수를 결정합니다.

분석 도구를 선택하고 측정값을 설정한 후, 형상 인자(shape factors), 페렛 직경(ferrets diameter), 면적 및 둘레를 선택하십시오. 매크로 코드를 사용하여 일련의 이미지들을 처리합니다. 이제 형상 인자 값의 결과가 기록된 스프레드시트를 엽니다.

각 이미지에 대해, 한 샘플의 모든 이미지를 사용하여 각 이미지의 형태학적 수치를 계산하십시오. 형태학적 수치의 평균값을 계산하십시오. 그래프 및 데이터 분석 프로그램을 사용하여 형태학적 수치를 비생산성과 함께 도표로 나타내십시오.

탈크 미세입자의 농도를 점진적으로 증가시켜 첨가함으로써 수학적 회귀 분석을 통해 수학적 관계를 결정합니다. Niger SKAN 10 15 8개를 사용합니다. 표준 조건에서는 예상되는 펠렛 형태가 나타나지만, 형태가 진정한 펠렛 형태에서 분산된 형태 또는 균사형 형태로 변화합니다.

흥미롭게도, 배지에 리터당 10 g의 탈크 미세입자를 첨가하면 균사 형태가 형성됩니다. 동시에 Beto Fructo tase의 활성이 약 3배 증가하며, 리터당 1 g 또는 3 g의 탈크 분말을 첨가하면 자동 이미지 분석으로 결정된 파라미터를 기준으로 과당 활성이 두 배로 증가하며 분산된 형태가 나타납니다. 미세입자 의존적 형태는 형태학적 분석을 통해 종합적으로 설명될 수 있습니다.

참고로, 매끄러운 펠릿 형태의 완벽한 구형 입자는 현미경 이미지에서 완벽한 원으로 나타납니다. 형태 계수는 표준 조건에서 1에 가까운 값을 갖습니다. 반응기 1의 형태는 약 0.8의 형태 계수를 나타냅니다.

10 g/L의 탈크 분말이 포함된 4번 반응기의 모폴로지는 모폴로지 수치가 약 0.1입니다. 탈크 분말 농도가 1 g/L 및 3 g/L인 2번과 3번 반응기의 모폴로지 수치는 이들 극단값 사이에 위치하며 분산된 모폴로지를 보여줍니다.

미세입자 의존적 형태는 베타-프럭토오제니케이스(beta fructose cytes)의 생산성과 밀접한 관련이 있으므로, 발달 후 형태, 수 및 생산성 사이에 우수한 수학적 상관관계가 존재합니다. 이 기술은 생명공학 분야의 연구자들이 균류의 형태와 특히 생산성과의 관계를 더욱 심층적으로 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 특정 형태의 균류 교배종을 상세하게 생성하는 이 절차를 통해, 사상성 미생물 배양의 다른 중요한 측면들을 탐구할 수 있습니다.

예를 들어, 균사 형태는 구상 형태보다 훨씬 더 점성이 높은 것으로 알려져 있습니다. 따라서 원하는 생성물의 분리 및 정제 과정에서 문제가 발생하여 공정의 전반적인 생산성이 저하됩니다. 본 연구의 형태학적 수치는 배양 및 프로토콜에 관한 모델을 수립하는 데 도움이 될 것이며, 일반적인 진균 형태학에 대한 이해를 넓혀줄 것입니다.