감염된 세포의 염색질에서 인플루엔자 바이러스 Ribonucleoprotein 컴플렉스의 동질 정제

Lyco 음성 가닥, RNA 바이러스. 인플루엔자 바이러스의 게놈은 바이러스 리보핵산단백질 복합체(VR nps) 형태로 패키징되며, 여기서 단일 가닥 게놈은 핵단백질에 의해 캡슐화되고 PA, PB1 및 PB2 서브유닛으로 구성된 폴리머라제 복합체와 결합합니다. 감염된 포유류 세포로부터 온전한 복합체를 정제하기 위해, HeLa 세포를 재조합 strept-tagged 인플루엔자 바이러스와 함께 배양합니다.

바이러스가 세포 내로 진입하면 감염 후 핵에서 바이러스 RNA가 합성됩니다. 이후 세포를 계면활성제를 사용하여 용해시킨 다음, 원심분리와 염분 기반의 크로마틴 분획 프로토콜을 통해 세포질, 핵 및 크로마틴 분획으로 분리합니다. 마지막으로, 각 분획에서 strept-tag가 붙은 VRP를 친화성 정제합니다. 정제된 vRNP의 단백질 및 RNA 조성을 은 염색법으로 분석한 결과, 본 프로토콜을 통해 크로마틴에 강하게 결합된 VRP조차 손상 없이 분리할 수 있음을 확인하였습니다. 따라서 인플루엔자 바이러스 리보핵단백질 복합체를 친화성 정제하는 표준 방법과 비교했을 때 본 프로토콜의 주요 장점 중 하나는, 인플루엔자 바이러스 mRNA 합성이 일어나는 곳으로 알려진 감염 세포의 크로마틴으로부터 vRNP를 정제할 수 있다는 점입니다.

따라서 본 방법은 바이러스 복제 및 전사 조절과 관련된 질문들에 답하는 데 사용될 수 있으며, 예를 들어 어떤 바이러스 또는 세포 인자가, 그리고 어떤 번역 후 수식(post-translational modifications)이 바이러스 mRNA 합성이나 바이러스 게놈 RNA 합성에 필요한지 등을 확인하는 데 활용될 수 있습니다. 다만, 핵 내 분획(sub nuclear fractionation)은 생화학적 조건에 매우 민감하며 세포주마다 크게 다를 수 있으므로, 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 어려움을 겪을 수 있습니다. 본 프로토콜은 감염 다중도(multiplicity of infection) 3으로 PB2 서브유닛의 C-말단에 strep tag가 유전적으로 융합된 인플루엔자 바이러스 RWSN PB2-strep을 감염시킨 세포를 사용하여 시작합니다.

차가운 PBS로 세포를 한 번 세척한 다음, 차가운 PBS 12 milliliters를 첨가하고 고무 스크래퍼를 사용하여 디쉬에서 세포를 제거합니다. 세포를 50 milliliter 원심분리관(conical tube)으로 옮긴 후 원심분리를 통해 펠렛화합니다.

이 절차에서 가장 어려운 부분은 세포 분획 프로토콜입니다. 세포 핵은 균질화 및 혼합 과정에 매우 민감하며, 이를 잘못 수행할 경우 크로마틴 추출물이 쉽게 손상될 수 있습니다. 따라서 여기서 보여드리는 균질화 기술뿐만 아니라, 용해물의 전반적인 취급 주의사항을 준수하는 것이 매우 중요합니다.

원심분리 후 상층액과 재현탁액(Resus)을 제거한 다음, 세포 펠렛을 10 milliliters의 차가운 자당 완충액(sucrose buffer)에 현탁합니다. 10 milliliter 플라스틱 혈청 피펫 끝에 200 microliter 피펫 팁을 부착하고, 세포를 통과시켜 세포 덩어리를 풀어줍니다. 현탁액을 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.

세포를 주기적으로 부드럽게 반전시켜 재부유시킵니다. 다음으로, non IET P 40을 최종 농도 0.5%가 되도록 첨가하고 고속으로 15초간 볼텍싱한 후, 즉시 탁상 원심분리기를 사용하여 4°C에서 3,500 ×g로 10분간 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 상층액을 제거하여 15 mL 원추형 튜브로 옮깁니다.

상층액을 4 °C에서 보관하십시오. 이것은 세포질 분획입니다. 펠렛은 여기에서 보는 바와 같이 원래의 세포 펠렛보다 크기가 더 작고 색이 더 하얗게 나타나야 합니다.

프로토콜을 나중에 완료할 예정이라면, 세포 펠렛을 4 °C에서 보관하십시오. 그렇지 않은 경우, 5 mL의 차가운 sucrose 완충액으로 펠렛을 세척하고 이전과 동일하게 원심분리하여 계속 진행하십시오. 원심분리가 완료되면 상층액을 버리고, 핵이 포함된 펠렛을 1.5 mL의 차가운 핵질 추출 완충액에 재현탁하십시오.

재현탁된 펠렛을 페스틀이 밀착된 냉각된 4 mL 전유리 덴스키(Dounce) 균질기로 옮기고, 20회 스트로크하여 핵을 균질화합니다. 거품이 발생하지 않도록 주의하며, 약 10회 스트로크 후에는 저항이 증가해야 합니다. 효율적인 균질화 여부를 확인하기 위해 위상차 현미경으로 샘플을 관찰합니다.

핵은 더 이상 둥근 모양이 아니어야 하며, 불규칙한 형태를 띠고 마치 터진 것처럼 보여야 합니다. 핵이 균질화되면, 이를 1.5 milliliter 마이크로 원심분리관으로 옮기십시오. 균질액을 회전 휠에서 4 °C로 20분 동안 배양하십시오.

그 다음 마이크로 원심분리기를 사용하여 4°C에서 10분 동안 16,000 ×g로 원심분리합니다. 원심분리 후 핵질 분획인 상층액을 1.5 mL 튜브로 옮겨 4°C에서 보관합니다. 그런 다음 37°C로 예열한 소화 버퍼 1.5 mL에 펠렛을 다시 현탁합니다.

그 후 해당 분획을 37 °C에서 10분 동안 배양합니다. 다음으로, 5 M sodium chloride 42 µL를 첨가하여 sodium chloride의 최종 농도를 150 mM로 맞춘 후 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. 4 °C의 마이크로 원심분리기에서 16,000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다.

원심분리 후, 상층액을 제거하여 4 °C에서 보관하십시오. 이것이 CH one 50 분획입니다. 펠릿을 1.5 mL의 차가운 고염 버퍼(high salt buffer)로 재현탁하고 얼음 위에서 20분 동안 배양하십시오.

4°C의 마이크로 원심분리기에서 16,000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 상층액을 제거하여 4°C에 보관합니다. 이것이 CH 500 분획입니다.

분획 프로토콜 동안 저장해 둔 분획물들을 꺼내 얼음 위에 둡니다. 그런 다음 세포질 분획물에 5 M sodium chloride 300 µL를 첨가합니다. 이어서 분획당 100 µL의 packed strep T in Sphero beads를 15 mL 원추형 튜브로 옮깁니다.

beads에 strep wash buffer를 10배 부피로 첨가합니다. 튜브를 뒤집어 혼합한 후, 탁상용 원심분리기에서 1000 ×g로 5분간 원심분리하고 상층액을 제거합니다.

버퍼 세척을 2회 반복한 다음, 펠릿을 동일한 부피의 strep wash buffer로 재현탁하고, 각 분획에 세척된 strep Act in bead slurry 200 µL를 추가합니다. 튜브를 4 °C에서 1시간 동안 회전시킵니다. 그 후 튜브를 4 °C에서 1000 ×g로 1분 동안 원심분리하고 상청액을 제거합니다.

그다음 15 mL 튜브에서 세포질 분획과 함께 배양한 비드에 세척 완충액 1 mL를 추가합니다. 세척 완충액을 넣고 비드를 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 비드를 1분 동안 세척한 다음, 4 °C에서 1000 ×g로 1분 동안 튜브를 원심분리합니다.

마지막 세척 단계 후 이 과정을 두 번 반복하십시오. 평평한 피펫 팁을 사용하여 세척 버퍼의 모든 흔적을 제거합니다. 그 다음 100 microliters의 용출 버퍼를 넣고 부드럽게 혼합한 뒤, 튜브를 얼음에 15분 동안 보관하십시오.

배양하는 동안 튜브 바닥을 가볍게 두드려 비즈를 가끔씩 섞어줍니다. 15분이 지나면 4 °C에서 1000 ×g로 1분 동안 원심분리합니다. 용출된 strep-tagged VRP가 포함된 상층액을 수집합니다.

세포를 인플루엔자 바이러스 WSN 균주로 9시간 동안 감염시킨 후, 분획된 용해물을 여기에서 보는 바와 같이 웨스턴 블로팅으로 분석하였습니다. 완만한 핵 분리법은 다량의 핵 단백질 방출을 방지하면서 튜불린과 같은 세포질 단백질을 효율적으로 추출합니다. 저염 상태에서 추출된 염색질 분획에는 전사에 중요한 단백질들이 농축되어 있음에 유의하십시오.

고염 분획에는 주로 뉴클레오솜이 포함되어 있으므로, 태그가 없는 바이러스, RWSN 또는 RWSN PB two strep로 9시간 동안 감염시킨 R 세포에서 용출된 세포질 분획의 단백질 조성을 결정하기 위해 v NPS를 은 염색으로 분석하였으며, 이는 세포질 용출액에 대해 나타낸 바와 같습니다. 여기서 95에서 100 kilodaltons 사이의 밴드와 비교하여 55 kilodaltons 이상의 주요 밴드에서 나타나듯이 NP 대 PA PB one, PB two의 비율이 높으며, 이는 대부분의 strep PB two가 완전히 형성된 VRNP의 일부로 정제되었음을 시사합니다. 즉, 상대적 수율을 비교했을 때 가용성 폴리머라아제는 거의 포착되지 않았습니다. RWSN PB two strep 또는 RWSN으로 9시간 동안 감염시킨 후 정제된 VR NPS를 은 염색한 결과가 이 은 염색 겔에 나타나 있으며, 감염 9시간 후 4가지 세포 분획 모두에서 v RMPs를 정제할 수 있습니다.

v RMP의 최고 농도는 핵질에서 발견되지만, 상당 부분은 세포질과 염색질에서도 정제할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 감염된 세포의 핵에서 손상되지 않은 인플루엔자 바이러스 리보핵단백질 복합체를 고수율로 정제하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 수행할 때, 깨끗한 완충액을 사용하고 샘플이 불필요하게 실온에 노출되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 이를 통해 RNA와 단백질의 분해는 물론 단백질 복합체의 해체를 방지할 수 있습니다.

또한 감염성 인플루엔자 바이러스를 다루는 것은 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오. 용해물에 NP 40를 첨가하기 전까지 모든 단계는 생물안전등급 2(biosafety level two) 작업대에서 수행해야 합니다.