단일 Oocyte의 Bisulfite의 돌연변이 유발

본 절차의 전반적인 목적은 단일 난모세포의 DNA 메틸화를 분석하는 것입니다. 이를 위해 우선 수집된 난모세포에서 난구 세포와 소프 팔리타(soap palita)를 제거합니다. 두 번째 단계는 극소량의 DNA가 손실되거나 분해되는 것을 방지하기 위해 난모세포를 2:1 비율의 aros 용해 용액에 임베딩하는 것입니다.

다음으로 비설파이트 돌연변이 유발을 수행한 후, 네스티드 중합효소 연쇄 반응(nested polymerase chain reaction)을 통해 증폭합니다. 마지막 단계는 PCR 산물을 결찰 및 클로닝하는 것입니다. 이후 클론을 선택하여 PCR로 증폭시킨 후 서열 분석을 위해 송부합니다.

최종적으로, 비설파이트 변이 유도 및 시퀀싱은 단일 난세포 내 관심 영역의 사이토신-포스페이트-구아닌, 즉 CpG 디뉴클레오타이드에서의 DNA 메틸화 상태를 확인하는 데 사용됩니다. 대량의 세포를 대상으로 하는 비설파이트 변이 유도와 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은, 여러 세포를 혼합하여 발생하는 PCR 편향 및 화학물질 오염 없이 단일 난세포로부터 데이터를 얻을 수 있다는 점입니다. 난세포 수집 당일에 서면 프로토콜에 기재된 용액들을 새로 준비하십시오. 용액을 조제할 때 장갑을 자주 교체하고 필터 팁을 사용하여 DNA 오염 가능성을 줄이십시오. 또한, 튜브를 열어둘 때는 입구가 바깥쪽을 향하게 기울여 두고, 사용하지 않을 때는 모든 튜브의 캡을 닫아 두십시오.

해부된 마우스 난관을 M2 배지에 넣고 M 펄리를 당겨 난구 세포 복합체(cumulus cell complex)를 추출하여 OSI 수집을 시작합니다. 그런 다음 30 µL의 M2 배지 방울 내에 0.3 mg/mL의 hyaluronidase 용액을 사용하여 난구 세포 복합체에서 난자를 분리합니다. 장시간 노출 시 난자가 손상될 수 있으므로, 난구 세포를 제거하는 데 필요한 최소한의 시간 동안만 난자를 용액에 유지하십시오.

난자를 30 µL의 M two 배지 방울로 옮겨가며 세척합니다. 세척 과정 중 주기적으로 누적세포를 제거하며, 총 3회 세척합니다. 산성 tyro 용액을 사용하여 LUCITA의 Z를 제거합니다.

먼저 난자를 30 µL의 용액 방울 하나에 넣은 후, 다시 다른 30 µL 용액 방울로 옮깁니다. 이는 함께 이동하는 배지가 산을 희석시켜 효율을 떨어뜨릴 수 있기 때문입니다. 장시간 노출 시 난자가 손상될 수 있으므로, 투명대를 제거하는 데 필요한 시간 동안만 용액에 유지하십시오.

투명대를 제거한 후, 난자를 30 µL의 M2 배지 방울에서 다시 세척합니다. Agros 임베딩을 수행하기 위해 먼저 용해 용액을 70 °C 히팅 블록 위에 올립니다. 예열된 저융점(LMP) Agros를 용해 용액에 추가하여 Agros와 용해 용액의 비율을 2:1로 맞춥니다. 그다음, 깨끗한 유리 슬라이드 위에 최소량의 M2 배지와 함께 난자 하나를 올립니다.

다음 단계는 단일 세포를 Agros 및 용해 용액에 매립하는 것입니다. Agros는 65 °C 미만의 온도에서 경화되므로 이 작업은 신속하게 수행해야 합니다. 현미경 하에서 피펫 팁을 사용하여 Agros 용해 용액 10 µL를 취하십시오.

약 1µL 이하의 agros 용해액을 슬라이드 글라스 위에 조심스럽게 분사하여 최소 배지와 섞이게 합니다. 피펫 팁으로 난모세포를 조심스럽게 집어 올립니다. 그런 다음, 생성된 비드가 구형이 되도록 300µL의 미네랄 오일이 들어 있는 einor 튜브에 10µL 전체를 넣습니다.

용해를 수행하기 위해 튜브를 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 미네랄 오일 300 µL를 제거하고 SDS 용해 버퍼 500 µL를 추가합니다. 다음 날, 50 °C로 설정된 워터배스에서 샘플을 하룻밤 동안 배양합니다.

서면 프로토콜에 설명된 대로 이설파이드 돌연변이 유발 솔루션을 신선하게 준비하십시오. 500 µL의 SDS 용해 버퍼를 완전히 제거함으로써 돌연변이 유발을 시작합니다. 남아 있는 용해 버퍼는 가열 시 agros를 희석시키며, 이후 단계에서 비드가 더 쉽게 용해될 수 있음에 유의하십시오.

용해 버퍼를 완전히 제거한 후, 미네랄 오일 300 µL를 첨가합니다. 시료를 90 °C 가열 블록에서 2분 30초 동안 배양합니다. 혼합하거나 젓거나, 온도를 변화시키지 않도록 주의하십시오.

2분 30초 후에 샘플을 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 변성을 수행하려면 미네랄 오일을 제거하고 튜브에 0.1 M 수산화나트륨 1 mL를 넣은 후, 튜브를 가볍게 튕겨주고 5~6회 뒤집어 섞습니다.

시료를 15분 동안 배양합니다. 37°C로 설정된 항온수조에서 3~4분마다 도립 혼합하며, 비드가 수산화나트륨 용액 속에 떠 있어야 합니다. 비드가 더 이상 튜브 바닥에 있지 않은지 확인하십시오.

아황산염 처리를 수행하려면 수산화나트륨을 제거한 후 튜브를 가볍게 원심 분리하십시오. 미네랄 오일 300 µL와 BIS 아황산염 용액 500 µL를 첨가합니다. 빛에 노출되지 않도록 주의하며 50 °C 항온 수조에서 튜브를 3시간 30분 동안 배양하십시오.

이제 탈염 과정을 수행합니다. 먼저 샘플을 얼음 위에서 3분 동안 배양한 후 미네랄 오일과 BIS sulfite 용액을 제거합니다. 가볍게 원심 분리한 후, 0.3 M 수산화나트륨 1 mL를 첨가하고 튜브를 5~6회 가볍게 쳐서 뒤집어 섞어줍니다.

샘플을 15분 동안 배양합니다. 37°C 항온수조에서 3~4분마다 한 번씩 뒤집어주며, PCR을 시작하기 전에 비드가 수산화나트륨 내에서 부유 상태여야 합니다. 먼저 가볍게 원심 분리하여 샘플을 세척합니다.

그런 다음 수산화나트륨을 제거하고 1x TE pH 7.5 1mL를 첨가합니다. 실온에서 5~10분 동안 흔들어 섞어줍니다. 다시 한번 가볍게 원심분리한 후, 1x TE를 제거합니다.

이 세척 과정을 두 번 반복합니다. 그 후, 오토클레이브 멸균된 2차 증류수 1 mL를 첨가합니다. 상온에서 5~10분 동안 흔들어 섞은 뒤, 세 번째로 가볍게 원심분리하고 물을 제거합니다.

2회 증류수로 세척 과정을 두 번 반복합니다. 마지막으로 상층액을 모두 제거하여 aros bead만 남깁니다. 상층액의 pH가 5.0인지 확인하십시오.

상청액이 여전히 너무 염기성인 경우, 2회 증류수로 비드를 다시 세척하십시오. 그동안 서면 프로토콜에 설명된 대로 PCR 튜브에 1차 PCR 믹스를 추가하십시오. 고체 agro speed를 einor 튜브의 입구 부분까지 밀어 넣으십시오.

그런 다음 agro speed를 PCR 튜브로 조심스럽게 옮기고 70 °C에서 1분 동안 가열하여 혼합한 후, 서면 프로토콜에 제안된 대로 증폭하십시오. 1차 증폭 후, 1차 산물 5 µL를 템플릿으로 사용하여 2차 PCR 반응을 준비하십시오. 반드시 미네랄 오일 층 아래에서 피펫팅하십시오.

본문의 지침에 따라 진단 테스트로서 2차 증폭을 수행하십시오. 2차 라운드 샘플은 메틸화 또는 균주 특이적 제한효소로 절단한 후, 8% acrylamide 겔에서 전기영동하여 소화 산물을 확인합니다. 생성된 불균일한 밴드는 하나 이상의 서열이 존재함을 나타냅니다. 2차 증폭 산물을 클로닝하려면 벡터에 라이게이션하고, 이 비디오에 동반된 원고에 기술된 대로 TA 클로닝을 수행하십시오. TA 클로닝 후, 모든 반응 혼합물을 ampicillin, x-gal 및 IPTG가 첨가된 LB 한천 배지에 도말하고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.

그 후 서면 프로토콜에 기재된 대로 colony PCR master mix를 PCR 튜브에 추가합니다. 피펫 팁으로 플레이트에서 흰색 세균 콜로니를 선택하여 PCR 튜브에 담긴 35 µL의 colony PCR master mix에 넣고 섞어줍니다. 텍스트에 기술된 대로 현탁액을 증폭합니다. PCR 증폭 후, PCR 생성물 4 µL를 1.5% AGROS 겔에서 전기영동합니다.

마지막으로, 사이트당 5개의 콜로니 PCR 결과물에 대해 분석하기 위해 PCR 생성물을 약 30 µL씩 시퀀싱에 보냅니다. 시퀀싱 결과가 나오면 메틸화 패턴을 읽을 수 있는데, 원래의 시토신-구아닌(cytosine guanine) 상태로 남아 있는 경우 메틸화된 것입니다. 반대로, 비설파이트 변환 프라이머를 이용한 네스티드(nested) PCR 증폭 후 원래의 시토신-구아닌이 티민-구아닌(thiamine guanine)으로 바뀌었다면 이는 메틸화되지 않은 것입니다.

아가로스 겔(agarose gel)에서 정확한 단편 크기를 시각화함으로써 성공적인 전환 여부를 확인할 수 있습니다. 두 개의 난모세포는 하나의 부모 대립유전자를 나타내며, 이론적으로는 하나의 각인된 메틸화 패턴을 가집니다. 이에 따라, 2차 PCR 산물을 통해 의도치 않은 오염 여부를 테스트할 수 있습니다.

DNA 메틸화에 민감한 제한 효소를 사용하여 2차 PCR 산물을 소화함으로써 메틸화된 대립유전자 또는 비메틸화된 대립유전자의 포함 여부를 평가할 수 있습니다. 여기서 효소 인식 서열 내의 메틸화된 사이토신이 절단됩니다. 반면, 티민으로 전환된 비메틸화 사이토신은 더 이상 효소에 의해 인식되지 않아 절단되지 않으며, 리게이션 및 형질전환 후 메틸화 및 비메틸화 대립유전자를 모두 포함하는 모든 제2감수분열 중기 난자 샘플은 난포 세포 오염이나 극체 포함을 나타내므로 폐기해야 합니다.

성공적인 colony PCR 증폭 결과는 AROS 젤에서 시각화하여, 정확한 산물 크기를 가진 샘플만 시퀀싱으로 보내도록 확인합니다. 본 예시에서 ligation 후 예상되는 앰플리콘 크기는 56bp입니다. 여기에서 clone 5는 앰플리콘 크기가 부적절하므로 시퀀싱으로 보내지 않아야 합니다.

제2 감수분열 중기 난자로부터 얻은 5개 개별 클론의 시퀀싱 결과는 5개의 동일한 메틸화 패턴과 동일한 non-CPG 전환율을 보여야 합니다. 하나 이상의 패턴이 포함된 샘플은 모두 폐기해야 합니다. 배란된 제2 감수분열 중기 난자는 두 개의 염색체 복사본을 가지거나 극체가 부착되어 있으므로, 두 개의 유사한 시퀀스 패턴이 얻어질 가능성이 있습니다.

메틸화 패턴이 매우 상이한 세포의 데이터는 폐기해야 합니다. 본 절차를 수행할 때 난구 세포 오염 가능성을 배제할 수 없으므로, HI IDE 처리 후 신선한 배지에서 난자를 여러 번 세척하여 가능한 한 많은 난구 세포를 제거하는 것이 중요합니다. 둘째로, 저융점 아가로스는 65°C 미만의 온도에서 굳으므로 주의하면서 신속하게 작업하십시오.

마지막으로, sodium bis sulfate와 hydroquinone은 빛에 민감하므로 반응 튜브와 용액을 알루미늄 호일로 감싸야 합니다.