단일 셀 및 단일 스파이크 해상도 suprathreshold 신경 활동의 광 기록

FollowMe 실험의 전반적인 목표는 수많은 뉴런으로부터 신경 스파이킹 활동을 기록하는 것입니다. 이는 첫 번째 단계에서 형광 현미경을 사용하여 각 활동 전위와 관련된 뉴런 세포체의 세포 내 칼슘 농도 증가를 관찰함으로써 달성됩니다. 고해상도의 공간 및 시간 분해능으로 40개 뉴런 세포체로부터 칼슘 형광 신호를 기록하기 위해 이광자 여기 및 랜덤 액세스 스캐닝 원리가 사용됩니다.

두 번째 단계에서는 디컨볼루션(deconvolution) 알고리즘을 사용하여 형광 신호로부터 정확한 스파이크 타이밍을 추출합니다. 이 기술을 이용하면 수십 개의 뉴런에서 발생하는 스파이크 활동을 기록할 수 있습니다. 이후 추출된 스파이크 데이터는 상호 정보량, 뉴런 집단 간의 신호 전달 또는 신경 상관관계를 측정하는 데 사용될 수 있습니다.

미세 전극 기록과 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 국소 집단 내 수많은 뉴런으로부터 뉴런 스파이킹 활동을 기록할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 정보 탐색의 상관관계의 중요성 및 피질 가소성에 따른 네트워크 역동성의 변화와 같이, 뉴런의 국소 네트워크 수준에서 피질 기능에 관한 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이광자 여기를 위해 펨토초 펄스를 생성하는 적외선 펄스 레이저 시스템이 사용됩니다. 시스템의 광학 부품으로 인해 발생하는 큰 손실을 보완하기 위해서는 높은 레이저 출력 전력이 필요합니다.

두 개의 프리즘으로 구성된 프리즘 쌍은 맞춤형 광학 편향기 이전에 레이저 펄스에 음의 그룹 속도 분산을 부여하여 AOD에 의해 도입된 시간적 분산을 보정합니다. 대구경의 AOD 두 개가 레이저 빔을 2차원으로 편향시킵니다. AOD에 의해 도입된 공간적 분산을 보정하기 위해 밀리미터당 100개의 그루브를 가진 반사형 회절 격자가 AOD 뒤쪽 13 cm 지점에 배치됩니다. 짧은 레이저 펄스를 사용할 때, 레이저 빔은 두 개의 릴레이 망원경을 통해 정립 현미경의 카메라 포트로 유도됩니다.

광학 부품들의 정렬을 위해 일정한 간격으로 아이리스(iris)를 배치합니다. 대물렌즈 앞의 다이크로익 빔 스플리터(dichroic beam splitter)는 적외선 여기광을 시료로 투과시키고, 시료에서 나오는 형광은 검출기로 반사시킵니다. 에피(Epi) 및 트랜스(trans) 형광 검출기는 대물렌즈를 통해 형광 신호를 수집하며, 여기광이 검출기에 도달하는 것을 방지하기 위해 검출기 앞에 콘덴서 색유리 필터를 배치합니다.

A OD 편향각은 디지털-아날로그 변환 보드가 장착된 컴퓨터에 의해 제어되며, 이는 다시 전압 제어 발진기를 구동합니다. 광전증배관의 신호는 차단 주파수가 100 kilohertz인 저역 통과 버터워스 필터를 통해 전달되며, 분석을 위해 컴퓨터에 저장되기 전 156.25 kilohertz 클록 속도의 아날로그-디지털 변환기에 의해 디지털화됩니다. 정렬 및 전기적 노이즈는 광전증배관의 저이득 및 고이득 상태에서, 그리고 지시약의 유무 및 레이저 광의 유무에 따른 형광 신호의 분포를 기록함으로써 테스트합니다. 디더링 랜덤 액세스 스캐닝은 세포 내 칼슘 증가의 검출에 의존합니다. 프로토콜의 첫 번째 단계는 볼루스 주입법을 통해 다수의 뉴런을 칼슘 지시약의 에스테르 형태로 염색하는 것입니다.

다음으로, 각 뉴런의 soma 활동을 4개 위치에서 각 위치당 6.4 microseconds 동안 기록합니다. 관심 뉴런을 선택하려면 256 by 256 픽셀로 구성된 전체 프레임을 획득하십시오. 그런 다음 이 이미지 내에서 기록할 뉴런의 중심을 수동으로 선택합니다.

제어 소프트웨어에 의해 매 사이클마다 각 중심 주변으로 2 µm 간격의 세 지점이 자동으로 추가됩니다. 총 40개 뉴런의 4개 지점에서 형광 신호를 기록합니다. 한 사이클 동안 모든 뉴런에서 기록하는 데는 1.536 밀리초가 소요됩니다.

모든 40개 뉴런에 대해 이러한 순차적 기록을 5초 동안 반복합니다. 형광 체세포 칼슘 신호를 통한 스파이크 검출은 높은 신호 대 잡음비에 의존합니다. 여기사 강도를 높임으로써 높은 신호 대 잡음비를 확보할 수 있습니다.

하지만 광손상으로 인해 들뜸 강도는 일정 한도까지만 높일 수 있습니다. 따라서 기록된 신호가 높은 스파이크 검출 범위 내에 있도록 보장하기 위해, 광손상은 낮으면서 신호 대 잡음비는 단일 스파이크를 검출하기에 충분한 매우 좁은 들뜸 강도 범위가 존재합니다. 실험 중에는 본 연구실에서 개발한 여러 온라인 분석 소프트웨어가 사용됩니다.

다음으로, 약 100에서 200밀리초의 짧은 기저 소음 시간 창을 사용하여 뉴런당 대략적인 광자 발생률을 계산합니다. 광자 수와 광자 발생률은 상대적 형광 변화의 분포를 이 방정식에 피팅하여 형광 값으로부터 계산하며, 이후 동일한 시간 창에서 기저 형광을 계산하여 이를 시간 또는 시행의 함수로 도식화합니다. 레이저 출력을 조정하여 기저 형광의 평균 감소율을 초당 0.0002 미만으로 유지하십시오.

이 한도를 초과하면 스파이크 검출률이 급격히 감소하기 때문입니다. 이후 10~20분마다 전체 프레임 이미지를 획득하여 뉴런 세포체의 위치를 확인하십시오. 필요한 경우 기록 위치를 조정하십시오.

신경 활동으로 인해 발생하는 형광 신호는 칼슘 일시적 변화(calcium transient)의 긴 감쇠 시간으로 인해 흔히 시간적으로 지연됩니다. 본 절차에서는 형광 신호로부터 스파이크 및 스파이크 타이밍을 추출하기 위해 디콘볼루션(deconvolution) 방법이 사용됩니다. 여기서는 유전 알고리즘을 사용하여 기록된 형광 신호에 가장 잘 부합하는 가능성 높은 스파이크 열(spike train) 모델을 결정합니다.

알고리즘의 각 반복 단계마다 최대 우도는 형광 기록의 노이즈에 의해 결정되는 최댓값에 점진적으로 수렴합니다. 균일하지 않은 뉴런 집단에서는 스파이크 유발 칼슘 신호가 뉴런마다 다를 수 있습니다. 대규모 데이터 세트의 비지도 분석을 위해, 본 연구진은 다수의 위양성 검출을 방지하고자 뉴런 간의 스파이크 유발 칼슘 신호 변이를 고려하는 알고리즘을 설계하였습니다.

단일 스파이크로 유도된 칼슘 과도 현상의 진폭과 감쇠 시간 상수의 결합 분포는 동일한 실험 조건 하에서 동일한 유형의 뉴런을 대상으로 한 별도의 실험 세트를 통해 기록되었습니다. 느린 기선 변화를 고려하고 디컨볼루션(deconvolution)의 계산 비용을 줄이기 위해, 각 기록의 각 뉴런에 대해 더 긴 기록물을 1~5초 길이의 여러 짧은 트레이스로 나누었습니다. 디컨볼루션 알고리즘은 최대 100만 개 이상의 매우 많은 모델을 테스트할 수 있으며, 디컨볼루션 속도를 높이기 위해 하나의 실험을 최대 10대의 서로 다른 컴퓨터에서 병렬로 처리하였습니다.

디콘볼루션(deconvolution) 후, 스파이크 데이터를 분석하고 검토합니다. 자극 주변 시간 히스토그램의 스파이크 확률과 뉴런 발화율을 자동 방식으로 계산합니다. 다음은 검출 창 내에서 매우 낮은 흥분율로 기록된 형광 신호의 예와 매우 높은 흥분율로 기록된 신호의 예입니다.

각 예시는 하나의 스파이크에 대한 반응을 보여준다는 점에 유의하십시오. 여기에는 급성 뇌 절편의 광학 현미경 사진과 동일한 피질 기둥에 배치된 두 개의 자극 피펫이 나타나 있습니다. 4층에서 이들은 반복적인 자극에 대한 신경 반응을 보여주며, 이 그래프는 기록된 뉴런 집단에 의해 신호화된 섀넌 상호 정보량을 보여줍니다.

다음은 서로 다른 피질 뉴런 집단 간의 임계값 초과 스파이킹 활동 전파를 측정한 결과입니다. 이는 시상피질 섬유의 전기 자극에 대한 피질 뉴런의 검출된 스파이크 반응입니다. 랜덤 액세스 스캐닝을 사용하여 뉴런 활동을 기록할 때는 검출 윈도우 내에서 기록하는 것이 매우 중요합니다.

그렇지 않으면 사용 불가능한 데이터 세트가 생성되기 매우 쉽습니다. 광학적 스파이크 검출(Optical spike detection)은 아직 초기 단계에 있으며, 개선의 여지가 많이 남아 있습니다.

몇 가지 개선 사항을 통해 우리는 더 많은 뉴런으로부터 기록을 수행합니다. 다른 개선 사항들을 통해, 깨어 있는 상태에서 행동하는 동물에서도 기록하는 것이 가능해질 것입니다.