동시 전압 클램프 및 Amperometry과 도파민 릴리스의 단일 세포 측정

이 절차의 목적은 동시 패치 클램프 및 파이로메트리(pyrometry)를 사용하여 DAT 매개 도파민 방출을 측정함으로써, 전압 클램프가 적용된 뉴런 내 도파민의 역수송을 측정하는 것입니다. 이는 먼저 도파민으로 파이로메트릭 전극의 무결성을 테스트함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 파이로메트릭 전극을 세포 근처에 배치하고 패치 피펫으로 뉴런의 홀셀 패치(whole cell patch)를 형성하는 것입니다.

다음으로, 패치 피펫으로 세포의 전압을 조절함과 동시에 파이로메트릭 전극을 사용하여 세포에서 방출되는 DAT 매개 도파민을 기록합니다. 마지막 단계는 DAT 차단제를 첨가하고 전세포 및 파이로메트리 전류를 다시 기록하여, 도파민 운반체에 의해 특이적으로 매개되는 전류를 뺄 수 있게 하는 것입니다. 이 기술의 의의는 도파민성 뉴런의 전압을 동시에 조절하면서 도파민 운반체를 통한 도파민의 역수송을 측정할 수 있다는 점에 있습니다.

동시 패치 클램프 및 기압 측정 기록 시스템에는 시스템을 위한 DC 광원을 생성하기 위해 우수한 DIC 광학계와 긴 작동 거리 렌즈를 갖춘 도립 현미경이 필요합니다. 전기적 노이즈를 낮추기 위해 현미경 조명을 자동차 배터리에 연결하십시오. 본 구성에서는 유압 마이크로 조작기가 노이즈 수준에 거의 영향을 주지 않기 때문에 이를 사용합니다.

전압 클램프, 전체 세포 기록(whole cell recording)을 위해서는 우측 조작기를 사용하고, 파이로메트리(pyrometry)를 위해서는 좌측 조작기를 사용합니다. 전체 세포 기록용 전극을 준비하려면, P 2000 풀러(puller)를 사용하여 쿼츠 파이펫을 뽑아냅니다. 일반적으로 3~4 MΩ의 저항을 가진 파이펫을 사용합니다.

다음으로, 1 mM 도파민이 포함된 피펫 용액으로 전극을 채웁니다. 그런 다음 이를 우측 매니퓰레이터의 피펫 홀더에 장착합니다. 도파민 함유 피펫 용액이 담긴 용기는 반드시 알루미늄 호일로 감싸고, 사용하지 않을 때는 얼음 위에 보관하십시오.

도파민은 산화될 수 있으므로, 용액을 얼음 위에 두고 빛으로부터 차단하여 보관하면 산화 속도를 낮출 수 있습니다. 은선을 전극 홀더에 끼운 다음, 전극 홀더에 파라메트릭 어댑터를 장착하십시오. 그다음, 은선과 접촉할 수 있을 만큼 충분한 양의 수은을 삼전극 전극에 채우십시오.

전극을 어댑터에 장착할 때, 현미경으로 pro CFE 저노이즈 탄소 섬유 및 파라메트릭 전극을 검사하여 팁이 깨끗하고 손상되지 않았는지 확인하십시오. 탄소 섬유의 팁이 손상되는 것을 방지하기 위해 탄소 섬유의 끝부분을 잡으십시오. 그런 다음 pro CFE Tric 전극을 장착하십시오.

이어서 조립된 전극을 왼쪽 유압 조작기에 장착하여 tric 전극의 무결성을 검사합니다. 이를 외부 용액이 담긴 유리 바닥 페트리 접시 속에 내립니다. 도파민이 없는 상태에서 기선 전류를 기록합니다.

그런 다음 10 µL의 1 mM 도파민 용액을 디시에 추가합니다. 성능이 좋은 암페로메트릭 전극(amperometric electrode)이라면 산화 전류의 증가가 기록될 것입니다. 실험 전후에 암페로메트릭 전극의 무결성을 반드시 확인하십시오.

본 절차에서는, 유리 바닥 페트리 접시에 담겨 배양기에서 도파민 운반체를 발현하도록 제작된 도파민 뉴런 또는 세포를 꺼냅니다. 따뜻한 외부 용액으로 세포 또는 도파민 뉴런을 세 번 부드럽게 세척합니다. 세포를 시각화하고 실험을 수행하기 위해, 유리 바닥 페트리 접시를 현미경 스테이지 위에 설치하고 세포가 명확하게 보이도록 정확한 초점을 맞춥니다.

다음으로, 패치 전극에 양압을 가합니다. 1mL 시린지를 사용하여 마이크로 조작기로 두 전극을 모두 용액 안으로 천천히 내리고 셀에 더 가깝게 이동시킵니다. 그런 다음 전위 측정 전극을 셀의 왼쪽에, 패치 전극을 오른쪽에 배치합니다.

패치 전극이 세포에 닿았을 때, 입이나 시린지를 이용해 가볍게 흡입하여 세포에 기가 씰(giga seal)을 형성합니다. 그 후, 흡입을 통해 씰을 파괴하여 whole cell 구성을 구현하고, 도파민이 포함된 내부 용액이 세포 내로 투석될 수 있도록 5분에서 8분 동안 기다립니다.

그 후 피펫을 통해 유지 전위 -40 mV에서 세포막 전압을 -60 mV에서 +100 mV 사이로 단계적으로 변화시켜 DAT 매개 전류를 기록합니다. 특이적 DAT 매개 도파민 유출을 결정하기 위해, DAT 길항제 부재 시와 존재 시의 실험적 전류를 기록합니다. 특이적 DAT 매개 전류는 길항제 없이 기록된 실험적 트레이스에서 DAT 길항제 존재 시 기록된 트레이스를 뺌으로써 결정합니다.

tric 전류의 상향 편향은 여기서 보여주는 도파민의 외부 유출에 해당합니다. 전체 세포 패칭 모드에서 2mM 도파민이 포함된 피펫을 사용하여, -60mV에서 +100mV 사이로 막 전압을 20mV씩 단계적으로 변화시켜 기록한 -4C mV 유지 전위에서의 DAT 매개 전류입니다. 여기는 전체 세포 전류와 동시에 획득한 앰페로메트릭 전류입니다.

이 영상을 시청한 후, 전압 고정된 뉴런에서 도파민 운반체를 통한 도파민의 역수송을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 실험 전후에 파라메트릭 전극의 무결성을 확인하는 것을 잊지 마십시오. 또한, 길항제가 없는 상태에서 기록한 트레이스에서 길항제가 있는 상태에서 기록한 트레이스를 차감하는 것을 잊지 마십시오.