Azoxymethane (AOM)과 Dextran의 황산 나트륨 (DSS)와 모델링 대장염 - 관련 암

0일 차에 Myer는 azoxymethane 또는 OM을 주입하고 다음 주에 다시 주입했습니다. 마우스의 음용수는 dextran sulfate sodium 또는 DSS가 포함된 용액으로 교체됩니다. 3주 차에 마우스는 이후 2주 동안 일반 물을 제공받습니다.

이 DSS 수분 주기를 두 번 더 반복합니다. 두 번째 DSS 주기 후에 거울 내시경을 통해 마우스의 종양 여부를 평가할 수 있습니다.

10주 후, 마우스를 희생시키고 결장을 적출합니다. 결장을 세척한 후 세로 방향으로 절개하여 엽니다. 결장을 통해 종양의 크기와 종양의 개수를 평가합니다.

결장(colon)의 종단면을 3등분하여 파라핀에 매립한 후 조직학적 분석에 제출할 수 있습니다. 광학 현미경을 사용하여 종양의 수를 측정하고 분류할 수 있습니다. 본 프로토콜에서는 유전독성 물질인 OM을 투여한 후, 전염증성 물질을 3주기 투여하는 방법을 시연합니다.

DSS는 인간의 Colitis associated cancer(염증성 장질환 관련 암)에서 관찰되는 것과 형태적 및 분자적으로 유사한 결장 종양을 마우스에서 빠르고 일관되게 유발합니다. 0일 차에 꼬리 표시 또는 귀 클립을 사용하여 마우스를 개별적으로 식별하고, 표에 각 마우스의 기초 체중을 기록한 다음, 각 마우스에 10 mg/kg 농도의 OM 용액을 주입합니다. OM은 유전독성 물질이므로 취급 시 주의하십시오. 7일 차에, 다음 일주일 동안 음용수로 2.5% DSS 용액을 공급합니다. 이 용액을 조제하려면, 증류수에 DSS 분말을 넣고 완전히 녹을 때까지 혼합하십시오.

용액을 0.2 micron 셀룰로오스 아세테이트 필터로 여과하면 준비가 완료됩니다. 7일 동안 DSS 용액을 지속적으로 공급하십시오. DSS는 2~3일마다 교체하십시오.

이 기간이 지난 후, 케이지를 다시 일반 식수로 교체하여 2주 동안 유지합니다. 주 2~3회 쥐의 체중을 측정하고 직장 출혈 및 설사 여부를 관찰합니다. 종양이 큰 쥐의 경우 일시적으로 직장 탈출증이 발생할 수 있으나, 이는 일반적으로 생존율을 감소시키지 않습니다.

기초선 대비 체중 감소는 결장염 중증도의 대리 지표로 사용됩니다. DSS 내시경 주기 완료 후 일주일 동안 최대 10%의 체중 감소와 함께 2~3일간의 설사 및 직장 출혈이 나타날 수 있습니다. 희생 전 생체 내에서의 종양 성장을 확인하기 위해 DSS의 두 번째 또는 세 번째 주기를 수행할 수 있습니다.

A-O-M-D-S-S 모델은 종양 형성 신뢰도가 상당히 높으므로, 일반적으로 이 단계는 필요하지 않습니다. 이 방법은 마우스의 종양을 손상시킬 가능성이 있으므로 소수의 마우스에 대해서만 평가를 수행해야 합니다. 작업 영역에는 멸균 인산 완충 식염수(phosphate, buffered saline) 또는 PBS가 담긴 비커와 빈 비커가 준비되어 있어야 합니다.

사용한 PBS를 제거하려면, 1회 사용 시마다 8~10 mL의 PBS를 시린지에 취해 내시경 끝단에 연결하십시오. 관강 내 내용물을 세척할 때는 흡입 또는 주사 진정제로 각 마우스를 마취시키고, 꼬리와 가슴 부위를 테이프로 평평한 보드에 고정하며 마우스 발바닥 패드를 집어 고정할 수 있습니다. 충분한 진정이 되었는지 확인하려면 엄지와 검지로 마우스의 하복부를 집어 항문을 노출시킨 후, muren 내시경을 마우스 직장 내로 진입시키십시오.

PBS를 사용하여 부드럽게 팽창시키고 세척함으로써 관강 내 시야를 확보하고 분변 내용을 제거합니다. 모니터를 관찰하며 내시경을 천천히 계속 진입시킵니다. 70일 차에 육안적 종양의 존재를 확인하면, A-O-M-D-S-S 처리를 받은 각 마우스는 다수의 결장 종양을 보유하고 있으며 평가 준비가 된 상태여야 합니다.

더 큰 종양을 얻고자 하는 경우, 이 단계는 수주에서 수개월까지 지연될 수 있습니다. 가바지 바늘(gavage needle)이 장착된 PBS 충전 주사기를 준비하십시오. 10% formalin이 충전된 주사기, 기본 수술용 가위, 끝이 둥근 가위를 준비하십시오.

1% Ian Blue 용액이 충전된 소형 주사기와 정밀 핀셋을 준비합니다. 또한, 냉각 트레이, 냉각된 PBSA가 담긴 웨이빙 보트, 절편 제작용 새 면도날, 그리고 10% 포르말린이 채워진 고정 용기를 배치합니다. 이소플루란과 경추 탈골 또는 기타 기관 승인 방법으로 각 마우스를 안락사시킵니다. 최종 체중 및 기타 측정값을 기록할 수 있습니다.

이때, 마우스의 복측이 위로 오도록 절단판 위에 놓습니다. 털이 해부 부위에 닿지 않도록 복부에 70% ethanol을 뿌립니다. 핀셋으로 복부 정중선을 잡고 피부에 작은 절개를 가하여 복막을 노출시킵니다.

부드럽게 견인하여 피부를 복막과 분리하고 복강 전체를 노출시킵니다. 복막을 절개하고 이 절개선을 양측 늑골연을 따라 확장합니다. 닫힌 가위를 사용하여 소장과 결장을 옆으로 밀어냅니다.

이렇게 하면 장간막 림프절이 노출되며, 선택적으로 이를 수확할 수 있습니다. 평가를 위해 비뇨생식관을 아래쪽으로 밀어내어 하행결장과 직장을 노출시키고, 골반을 더 자세히 노출시키기 위해 방광과 생식기관을 필요에 따라 절제합니다. 이때 인접 조직이 손상되지 않도록 주의하십시오.

하치골지와 상치골지를 절개하여 항문-직장 접합부를 노출시킵니다. 부드럽게 위쪽으로 견인하면서 항문-직장 접합부 주변의 피부를 절개하여 결장을 분리합니다. 장간막 포셉을 사용하여 결장의 부착 부위를 절제하거나 떼어냅니다.

항문-직장 접합부의 피부 일부를 유지하는 것이 중요한데, 이 영역은 흔히 이형성증의 영향을 받기 때문입니다. 맹장 바로 근위측에서 대장을 소장으로부터 절단하십시오. 5 mL 시린지에 장착된 18게이지 gavage 바늘을 사용하여 맹장을 인접한 결장으로부터 분리하십시오.

끝이 둥근 가위를 사용하여 액체가 생리적 방향으로 배출되도록 대장을 차가운 PBS로 세척합니다. 장간막을 따라 대장을 절개하여 엽니다. 절개한 대장을 차가운 트레이 위에 펼쳐 놓습니다.

조직이 얼지 않도록 트레이가 충분히 해동되었는지 확인하십시오. 종양을 더 잘 시각화하기 위해 손가락을 사용하여 1%Ian Blue를 몇 방울 도포합니다. 자로 종양의 수와 크기를 측정하거나 디지털 분석을 위해 사진을 촬영하십시오.

이 시점에서 RNA 단백질 또는 면역조직화학적 방법을 통한 향후 분석을 위해 인접 정상 조직 내의 작은 종양 구역을 절제할 수 있으며, 조직학적 평가를 위해 결장의 일부를 남겨둡니다. 주사기나 손가락을 사용하여 냉각 트레이 위에 놓인 나머지 결장에 10% formal을 도포하고, 조직이 최소 30초 동안 고정되도록 합니다. 이렇게 하면 고정 용기로의 이송이 용이해집니다.

동일한 트레이 위에 새로운 개방 결장을 도말하기 전에 잔류 포르말린을 깨끗이 닦아내십시오. 결장을 10% 포르말린이 채워진 용기로 옮기고 가장자리를 핀으로 고정합니다. 3시간 동안 고정한 후, 포르말린을 버리고 70% 에탄올로 교체하십시오.

결장은 70% ethanol에 무기한 보존할 수 있습니다. 낮은 열을 가해 2% agar 용액을 만들고, 유리판 위에 깨끗한 슬라이드를 준비합니다. 고정된 결장을 3등분으로 자르고, 사용하지 않는 조각들은 ethanol 용기에 다시 넣습니다.

두 개의 면도날을 사용하여 각 절편을 균일한 크기로 다듬습니다. 깨끗한 슬라이드 위의 agar에 결장 절편과 층을 매립합니다. 다음 결장에 대해서도 이 과정을 반복합니다.

절편을 절단하고 과잉 한천을 제거한 후, 포매된 결장을 카세트에 넣어 처리하고 hematoxylin 및 eosin으로 염색합니다. 그림 1은 결장염 관련 암 유도 프로토콜을 설명합니다. 그림 2는 OM 및 DSS 투여 기간 동안 기저치 대비 마우스의 체중 변화를 보여줍니다.

각 DSS 주기 이후 일주일 동안 마우스의 체중이 5~10% 감소한다는 점에 유의하십시오. 이 실험에서 체중 감소는 결장염 중증도를 나타내는 대리 표지자입니다. 그림 3은 A-O-M-D-S-S 처리 50일 차에 마우스 내시경을 통해 관찰한 원위 결장의 종양 모습입니다.

정상 결장과 비교하여 패널 B와 C에서 원위 결장의 내강을 폐쇄하고 있는 다수의 폴립양 종괴를 확인하십시오. 패널 A의 그림 4는 종양의 육안적 외형을 보여주는 종단면으로 절개된 마우스 결장을 보여줍니다. 원위 결장에서 더 높은 종양 부하가 관찰되며, 종양 성장이 거의 없는 근위 결장의 특징적인 위축된 질감을 확인하십시오.

그림 5는 lc와 blue 염색을 통해 강조된 종양을 보여줍니다. 염색제가 결장의 정상적인 조직감뿐만 아니라 각 개별 종양의 경계를 어떻게 강조하는지 확인하십시오. 이러한 염색은 자 또는 디지털 측정법을 통해 종양 영역을 정밀하게 측정하는 데 유용할 수 있습니다.

그림 6은 OM 및 DSS를 처리한 마우스당 평균 종양 수의 대표적인 분포를 보여줍니다. 대부분의 종양은 원위 결장에 위치하며 크기가 2mm 미만이라는 점에 유의하십시오. 그림 7은 카세트에 담긴 결장의 파라핀 매립 종단면과 H&E 염색 슬라이드를 보여줍니다.

잔류 S 및 블루 염색은 h 및 e 염색을 방해하지 않는다는 점에 유의하십시오. 슬라이드 이미지에는 큰 종양이 원으로 표시되어 있습니다. 원위부, 중간부 및 근위부의 구분은 맹장과 항문 사이의 전체 결장을 3등분 하여 절단한 결과입니다.

그림 8은 원위 결장에서 OM 및 DSS 투여로 인해 발생한 종양의 대표적인 조직학적 소견을 보여줍니다. 제시된 광학 현미경 사진은 H and E, B-R-D-U 및 beta-catenin으로 염색되었으며, 인간의 결장 선암과 유사한 이형성 변화를 보여줍니다. 본 영상에서는 OM 단회 주사 후 DSS를 7일 주기로 3회 투여하여 염증 유도성 마우스 결장 종양 발생을 구현하는 프로토콜을 시연하였습니다.

10주의 기간 동안, 이 모델은 인간의 염증성 장질환 관련 대장암에서 발생하는 것과 매우 유사한 조직학적 및 분자적 변화를 동반한 종양을 유도하며, 이 질환의 종양 발생 및 화학 예방 연구를 위한 매우 가치 있는 모델을 제공합니다.