3 차원 Heterotypic

다음 실험의 전반적인 목표는 초기 단계 난소암 발생의 3차원 전형적 모델을 생성하는 것입니다. 먼저, 일차 정상 난소 상피 및 섬유아세포 조직에서 유래된 H turt 불멸화 세포주를 생성합니다. 그 다음, 난소에 존재하는 생체 내 구조와 복잡한 세포 간 상호작용을 재현하기 위해 상피 및 기질 세포주를 3차원 S 스페로이드 모델로 공배양합니다. 이어서 오가노이드 배양물을 고정 및 염색하고 특정 마커의 발현을 분석하여 기질-상피 상호작용의 분자적 특성을 연구합니다.

얻어진 결과는 3D 정형 모델의 기질 세포 구획의 변화가 공배양된 상피 세포의 표현형에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지를 보여줍니다. 3차원 정형 모델은 이 질환의 기원을 탐구하고 종양의 발생 및 발달에서 기질 미세환경의 역할을 규명하는 것과 같이, 난소암 연구 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이러한 기술의 응용은 다른 3D 배양 방법들과 비교하여 질병 진단 및 치료로까지 확장됩니다.

이 기술은 더 넓은 범위의 세포 배양 부피와 후속 응용 분야에 적용될 수 있습니다. 예를 들어, 3D 동종 및 유형 배양은 인비트로(in vitro) 약물 테스트에 사용될 수 있습니다. 또한 이 접근 방식은 다른 고형암 유형이나 양성 질환 연구와 같은 다른 모델 시스템에도 적용 가능합니다.

신선한 난소 조직을 추가 항생제와 항진균제가 첨가된 불멸화 정상 난소 섬유아세포 성장 배지에 담아 세포 배양실로 운반합니다. 조직에 느슨하게 부착되어 남아 있는 상피 세포를 제거하기 위해 5 mL의 PBS로 샘플을 세 번 세척합니다. 그 다음, 샘플과 PBS를 깨끗한 P 100 배양 접시로 옮깁니다. 멸균된 기구를 사용하여 조직을 두 번째의 건조하고 깨끗한 P 100 배양 접시로 옮깁니다.

조직을 0.5 square centimeter 크기의 조각으로 자르고, 각 조각을 별도의 P 100 dish로 옮깁니다. 조직을 1 square millimeter 미만 크기의 조각이 될 때까지 계속 자릅니다. 그 후 20 milliliters의 INOF GM media를 첨가하고 배양합니다. 위상 현미경을 사용하여 세포 성장을 관찰합니다.

24시간 이내에 세포가 디쉬에 부착되었는지 확인하십시오. 위상차 현미경을 사용하여 세포 성장을 관찰하십시오. 세포는 일반적으로 24시간 이내에 디쉬에 부착됩니다. 일주일 후, 흡입법으로 부착되지 않은 조직을 제거하고 배지를 보충하십시오. 그 후 1~3주 동안 세포 콜로니의 크기가 약 500 microns가 될 때까지 일주일에 두 번 배지를 교체해 주십시오.

트립스(trips)와 코팅된 클로닝 디스크를 사용하여 클론을 분리합니다. 100% 섬유아세포성 세포임을 확인하기 위해, 세포주 샘플을 유리 커버슬립에 도말하고 섬유아세포 마커, 상피 마커 및 혈관 내피 세포 마커에 대한 면역형광 염색을 수행합니다.

H Turt passage의 레트로바이러스 형질전환 하루 전, 단일 P 100 디쉬에서 정상 난소 섬유아세포 분리물을 세 개의 P 100 디쉬로 분할합니다. 미리 제조된 바이러스 상청액은 구매하거나 HEC 2 9 3 T 세포의 공동 형질전환을 위한 표준 프로토콜을 사용하여 내부적으로 생산할 수 있습니다. poly Hema 용액을 준비하려면 poly hema 1.5 grams를 측정하여 멸균 병에 넣습니다.

분자 생물학 등급의 절대 에탄올 95 milliliters와 세포 배양 등급의 증류수 5 milliliters를 첨가합니다. poly Hema 용액이 완전히 용해될 때까지 65 degrees Celsius의 항온수조에 둡니다. 새로 제조한 poly Hema 용액으로 조직 배양 접시를 코팅합니다.

층류 후드 내에서 세포 배양 접시를 공기 건조합니다. 크기가 큰 접시나 플라스크의 경우, 로킹 플랫폼에서 부드럽게 흔들어주면 코팅이 균일하게 이루어지도록 할 수 있습니다. polyus 용액이 너무 빨리 마르면 표면이 매끄럽지 않게 됩니다.

필요한 경우, 3D 배양 전에 섬유아세포를 전처리합니다. 예를 들어, 노화를 유도하려면 치사량 미만의 과산화수소로 세포를 전처리하십시오. 3D 이소성 스테로이드를 구축하는 데 충분한 세포를 준비하기 위해, in vitro에서 INOF 및 상피 세포 배양물을 회복시키고 증식시킵니다. PBS로 5분 동안 세척한 후, poly hema 플레이트에 배지 15 milliliters를 추가합니다.

그동안 불멸화된 정상 난소 섬유아세포에 trypsin을 첨가하여 배양 접시에서 세포를 분리합니다. 3~5분 후, 동일한 부피의 배양 배지를 넣어 trypsin을 중화시키고 원심분리를 통해 세포를 수확합니다. 세포 펠릿을 5 mL 배지에 재현탁하고 피펫팅이나 부드러운 볼텍싱으로 잘 혼합합니다.

그 다음, 10 µL의 샘플을 사용하여 trypan blue로 생존 세포 수를 측정합니다. 이제 poly-HEMA가 코팅된 플레이트에 이미 분주된 배지에 4 million 개의 INOF 세포를 추가합니다. 배지 부피를 20 mL로 맞춘 후 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양합니다.

위상차 현미경으로 세포가 다세포 구상체로 응집되는 것을 관찰하여 2~3일마다 S spheroid 배양액을 교체해 줍니다. 플레이트를 피펫 위에 비스듬히 세워 둡니다. 구상체가 가라앉을 때까지 기다린 후, 5 mL 피펫을 사용하여 소모된 배지 약 16 milliliters를 조심스럽게 제거합니다.

7일째에 배양액에 16 milliliters의 신선한 배지를 추가하고 인큐베이터로 다시 옮깁니다. 섬유아세포 phe에 상피세포를 추가하여 이종 배양물을 생성합니다. 먼저, 세포 수를 측정하고 앞서 설명한 대로 트립신을 사용하여 난소 상피세포 현탁액을 준비합니다.

상피세포 성장 배지로부터 성장 인자가 이월되는 것을 방지하기 위해 INOF GM 배지로 한 번 세척합니다. 섬유아세포 OID 배양액을 보충한 후, 섬유아세포와 상피세포의 비율이 4:1이 되도록 상피세포를 추가합니다. INOF GM에서 이종 OID는 14일 동안 2~3일마다 배지를 교체하며 배양합니다.

면역조직화학 염색을 위해, 중성 완충 포르말린으로 PHE를 고정하고, PHE를 원심 분리하여 펠릿화한 후 포르말린을 70% ethanol로 교체합니다. 인체 조직에 사용되는 표준 프로토콜에 따라 파라핀 포매 과정을 진행합니다. 파라핀에 포매된 스테로이드는 절편을 만들어 H&E 염색 또는 면역조직화학법을 이용한 특정 분자 마커 염색을 수행할 수 있습니다.

또는, 스테로이드를 PBS로 세척하고 4%para formaldehyde로 고정합니다. 그 다음 샘플을 OCT 배지에 매립하고 급속 냉동하여 크라이오스탯 절편 제작 및 면역형광 염색을 거쳐 유세포 분석기로 분석합니다. 스테로이드를 PBS로 세척하고 37 °C에서 트립신 또는 Accutane 소화를 통해 해리합니다.

1mL 피펫 팁으로 용액을 위아래로 피펫팅하여 스테로이드를 단일 세포 현탁액으로 완전히 해리시킬 수 있습니다. 이때 세포가 과도하게 커지지 않도록 주의하십시오. 동일한 부피의 배양액으로 반응을 중화시키고, 현탁액을 40~70 micron 세포 스트레이너에 통과시켜 세포 덩어리를 제거합니다. 그런 다음 세포를 펠렛화하고 PBS로 세척한 후 세포 수를 측정하며, 필요한 수의 세포를 FACS 버퍼에 재현탁하고 제조사의 지침에 따라 염색합니다. 본 연구실에서는 난소 상피 세포를 부분적으로 형질전환시킨 후, 이 세포들을 정상 및 노화된 난소 섬유아세포와 공배양하여 초기 단계의 난소암 발달 과정을 모사하였습니다.

폐경 전 난소의 h hert 불멸화 정상 난소 섬유아세포에 대한 면역형광 염색 결과, 일차 정상 난소 섬유아세포와 불멸화 정상 난소 섬유아세포 모두 섬유아세포 특이 단백질을 발현했으나, cytokeratin seven은 발현하지 않고 vimentin을 발현하는 것으로 나타났다. 3D 형태의 PHE에서 단독 배양된 정상 난소 섬유아세포는 방추형 형태와 풍부한 세포외 기질을 나타낸다. 본 실험에서는 정상 난소 섬유아세포를 과산화수소에 7일 동안 노출시켜 노화를 유도한 후, 부분적으로 형질전환된 난소 상피세포와 함께 14일 동안 배양하였다.

두 세포 유형을 구분하기 위해, 생성된 스페로이드를 증식 마커인 mim one과 상피 마커인 pan cytokeratin으로 면역 염색하였습니다. 데이터 정량 분석 결과, 노화된 미세환경은 부분적으로 형질전환된 상피 세포의 신생물적 특성을 촉진하는 반면, 정상 미세환경은 신생물 진행을 억제하며, 세포를 단층 배양했을 때는 검출되지 않았던 정상 세포와 악성 세포의 조직학적 특징이 복원됨을 시사합니다. 예를 들어, 세포를 스페로이드 배양으로 전환하면 투명 세포 난소암 세포주의 3D 배양에서는 투명 세포 난소암의 조직학적 특징이 검출되지만, 동일한 세포의 단층 배양에서는 검출되지 않습니다.

이 영상을 시청한 후, 상피 세포와 기질 세포 사이의 상호작용을 연구하기 위한 3차원 전형적 배양법을 설정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이는 초기 종양 발생 단계에서의 연구에 해당합니다. 3D 배양을 설정할 때는 처리 과정 중 일부 재료의 손실이 발생할 수 있음을 고려하여, 후속 응용 단계에 맞춰 세포 수를 조정하는 것이 중요합니다.

이 절차를 숙달하면 3D 배양을 1시간 내에 설정할 수 있습니다. 단층 배양 조건에서는 검출되지 않지만 3D 전형적 배양에서 발생하는 전반적인 유전자 발현 변화를 분석하기 위해, 유전자 발현 마이크로어레이 프로파일링과 결합된 유세포 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이를 통해 3D 핵심 배양 미세환경에서 특이적으로 발생하는 양방향 신호 전달 경로를 분석할 수 있습니다.