기능화 비스 - 펩타이드의 고상 합성은 방법론 "을 안전 잡아라"사용

다음 실험의 전반적인 목표는 고상 합성 기술을 사용하여 기능화된 BSP 펩타이드를 합성하는 것입니다. 이는 보호된 BIS 아미노산을 하이드록시에틸 벤조산 수지에 결합시킴으로써 이루어집니다. 그 후 기능화된 bis 아미노산을 부착하기 위해 심층 보호 결합 사이클을 반복하며, 이 과정을 통해 BIS 펩타이드를 연장하고 원하는 기능성을 구현합니다.

마지막으로, DI Keto pyrazine 형성을 통해 수지에서 BIS 펩타이드를 절단하기 위해 첫 번째 bis 아미노산을 알파 아미노산으로 수식합니다. 액체 크로마토그래피 질량 분석법(liquid chromatography mass spectrometry analysis) 분석 결과, 양호한 조순도와 약 10%의 일관된 분리 수율로 기능화된 BSP 펩타이드가 성공적으로 합성되었음을 확인하였습니다. BIS 펩타이드는 고체 수지 상에서 조립되므로 용액 내 반응보다 조작이 더 쉽고 여과를 통해 부산물을 용이하게 제거할 수 있어, 이 기술은 bis 펩타이드의 병렬 및 라이브러리 합성에까지 응용될 수 있습니다.

많은 단계에서 모든 반응이 최대한 완결에 가깝게 진행되도록 하기 위해 필요한 중요한 세부 사항들이 많아 습득하기 어렵기 때문에, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 고상 합성과에서는 중간체를 정제할 방법이 없습니다. 따라서 깨끗한 최종 생성물을 얻기 위해서는 모든 반응이 가능한 한 최대한 진행되어야 합니다.

단계가 반복적인 특성을 가지고 있으므로, 혼동을 피하기 위해 실험 절차 체크리스트를 작성하는 것을 권장합니다. 본 프로토콜은 첫 번째 BSP 펩타이드의 로딩, 첫 번째 BSP 펩타이드의 보호 및 동시에 진행되는 레진 캡핑으로 시작합니다. 먼저 8 mL 반응 용기에 H-M-B-A-A 레진 114 mg을 정밀하게 달아 넣고 마그네틱 스터 바를 추가하여 첫 번째 BSP 펩타이드 로딩을 시작하십시오.

고무 격막(septum)으로 용기 상단을 밀봉하고 Argon으로 튜브를 최소 5분 동안 퍼지합니다. 그동안 서면 프로토콜에 기술된 대로 활성화된 BIS 아미노산 용액을 준비합니다. 이 영상과 함께, 주입기를 사용하여 용액을 반응 용기에 옮기고 Argon 분위기 하에서 하룻밤 동안 교반한 후 다음 날 격막을 제거하고 반응 혼합물을 배출합니다.

수지에 약 2 mL의 클로로메탄을 첨가하여 세척합니다. 30초에서 1분 동안 교반한 후 배수합니다. 이 과정을 DCM으로 4회 반복한 다음, 디메틸포름아미드로 수지를 5회 세척합니다.

첫 번째 bis 아미노산의 보호기를 제거하고 동시에 수지 캡핑을 수행하기 위해, 33% hydrogen bromide(acetic acid 및 DCM 용액) 2 mL를 반응 용기에 천천히 첨가합니다. 15분 동안 교반한 후, DCM으로 수지를 다섯 번 세척하고 배수합니다. 이 D 보호 제거 과정을 한 번 더 반복합니다.

다음으로, 수지를 DCM으로 5회 세척한 후 DMF로 5회 세척하고, DMF 내 5% volume, volume D-I-P-E-A 용액으로 2회 세척하여 수지를 중화합니다. 그 후 DCM으로 5회, DMF로 5회 다시 세척합니다. 이제 보호된 기능성 비스 아미노산의 커플링을 수행할 수 있습니다.

먼저, 무수 DCM으로 세 번 세척하여 수지가 포함된 반응 용기에 불활성 분위기를 다시 도입합니다. 그 다음, 세푿(septum)과 아르곤 라인을 연결하여 퍼지하고, 무수 DCM 1~2 mL를 첨가한 뒤 30초 동안 교반하여 용기를 세척합니다. 이후 아르곤 라인의 버블러가 상승하기 시작할 때까지 용기의 액체를 배출합니다.

이 과정을 최소 한 번 더 반복하십시오. 다음으로, 아르곤 분위기 하의 화염 건조된 시험관에 기능화된 비스아미노산 용액을 준비합니다. 47 µL의 DIC를 첨가하고 90분 동안 교반하십시오.

그 다음, 666 µL의 무수 DMF에 D-I-P-E-A 35 µL를 혼합하여 레진에 첨가하고 5분 동안 더 교반합니다. 주사기를 사용하여 미리 활성화된 BIS 아미노산 용액을 용기에 옮기고 다음 날까지 하룻밤 동안 교반합니다. 반응 혼합물을 배출하고 아르곤 분위기 하에서 무수 DCM으로 2회 세척합니다.

본 절차에서 중요한 단계는 bis 아미노산 커플링입니다. di keto piperazine의 고리 폐쇄를 확실히 하기 위해, 추가 활성화제를 사용하여 반응 시간을 늘립니다. di keto pyrazine의 폐쇄를 촉진하려면, HOAT 및 DIC 용액을 첨가하고 아르곤 기체 하에서 1시간 동안 교반하십시오.

다음으로, 격막(septum)을 제거하고 반응 혼합물을 배출합니다. 수지를 DCM으로 5회, DMF로 5회 세척합니다. 이 섹션에서는 기능화된 BIS 아미노산의 심층 보호, Fmoc의 심층 보호 및 첫 번째 BIS 아미노산의 아실화(acylation) 과정을 다룹니다.

보호된 기능성 비스 아미노산의 심층 보호를 수행하려면, TFA와 TIPS 혼합 용액 2 mL를 반응 용기에 천천히 가하고 1시간 동안 교반합니다. 용액을 배출한 후 레진을 DCM으로 약 30초 동안 세척하고 다시 배출하며, 이 DCM 세척 과정을 5회 반복합니다. 그다음 A-D-C-M-D-M-F 세척 순서에 따라 레진 세척 전체 과정을 반복합니다. DMF 내의 5% v/v D-I-P-E-A 용액으로 두 번 세척하여 레진을 중화합니다.

그 다음 D-C-M-D-M-F 세척을 한 번 더 수행합니다. 이 단계부터 BIS 펩타이드를 다른 기능화된 bis 아미노산으로 연장하거나, 선도 질소 카복실산에 기능기를 도입하거나, 또는 두 가지 모두를 수행할 수 있습니다. FM 그룹을 제거하려면 DMF에 20% piperidine을 녹인 용액 2 mL를 첨가하고 20분 동안 반응물을 혼합합니다.

DMF로 수지를 다섯 번 배출하고 세척합니다. 수지를 추가로 세척한 후 이 과정을 한 번 더 반복합니다. 마지막 단계로 준비된 아미노산 용액을 반응 용기에 넣고 6시간 동안 교반하여 첫 번째 bis 아미노산을 분리합니다.

레진을 DCM으로 5회, DMF로 5회 세척합니다. 본 프로토콜의 마지막 단계는 레진 결합 아미노산에서 Bach 그룹을 제거하고 레진으로부터 절단하는 과정을 포함합니다. 먼저, 1:1 비율의 TFA-DCM 용액 2 mL를 반응 용기에 넣고 30분 동안 교반합니다.

레진을 DCM으로 5회 배수 및 세척하십시오. 그런 다음 이 과정을 한 번 더 반복하십시오. DCM으로 5회, DMF로 5회, 각각 30초 동안 레진을 세척 및 배수하십시오.

다음으로, 무수 DMF에 10%D-I-P-E-A가 포함된 용액 2 mL를 첨가하고 24~48시간 동안 교반합니다. 마지막으로, 반응 혼합물을 미리 무게를 잰 둥근 바닥 플라스크에 수집합니다. 이 용액 30 µL를 lc MS 바이알에 담긴 450 µL의 Tetra Hydro FU로 옮겨 분석을 의뢰합니다.

DMF를 추가로 분주하여 수지를 세척하고 라운드 플라스크에 수집합니다. 합성 과정 전반에 걸쳐 수지 상의 화학적 변환을 모니터링하기 위해 다음 방법들을 사용할 수 있습니다. 유리 히드록실기를 검출하려면, 먼저 일회용 피펫을 사용하여 약 1mg의 건조 수지를 취한 후 메틸 레드 테스트를 수행합니다.

4 mL 반응 용기에 옮겨 헹굽니다. 본문에 설명된 대로 조제한 메틸 레드 용액을 첨가하고 5~10분 동안 교반합니다. DCM으로 레진을 5회 배수 및 세척합니다. 오렌지색 또는 빨간색 레진 비드는 유리 히드록실기의 존재를 나타냅니다.

이 테스트는 첫 번째 bis 아미노산 로딩 및 레진 캡핑 단계를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 2차 아민을 검출하려면 일회용 피펫을 사용하여 약 1mg의 건조 레진을 작은 바이알에 옮겨 chloral 테스트를 수행하십시오. DMF 용액에 녹인 0.8mM chloral과 DMF 용액에 녹인 2% 산성 알데하이드를 각각 세 방울씩 첨가합니다.

실온에서 5~10분 동안 방치합니다. 이 경우, 수지 비드의 색상이 파란색 또는 보라색으로 변하는 것은 수지에 결합된 화합물에 유리 2차 아민이 존재함을 나타냅니다. 활성화 효율을 확인하기 위해 활성화 트랩 테스트를 수행합니다. 합성 중 활성화된 화합물은 활성화 용액 5~10 µL를 50 µL의 olaine이 담긴 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS) 바이알에 옮긴 후 수동으로 혼합하여 평가할 수 있습니다.

수 초 동안 용액이 노란색으로 변해야 하며, 이후 450 µL의 tetra hydro uran으로 희석하여 lc MS 분석에 제출합니다. 최종 생성물과 활성화된 중간체는 C 18 역상 컬럼과 0.1% formic acid가 포함된 물-acetyl nitrile 용매 시스템이 장착된 LCM S 시스템을 사용하여 평가할 수 있습니다. 이 L-C-M-S-U-V 트레이스는 조생성물의 우수한 순도에 대한 예를 보여줍니다.

21.3분에 나타난 스펙트럼의 주요 피크는 예상되는 생성물 질량과 일치하는 마스크를 갖는 것으로 확인되었습니다. 이는 조생성물의 질량 분석 스펙트럼에서 시각화할 수 있으며, 여기서 피크는 해당 질량과 나트륨 이온의 질량이 합쳐진 주요 피크뿐만 아니라, 해당 질량에서 IV DDE 보호기 질량을 뺀 주요 피크를 나타냅니다. 여기에는 21.3분에서 매우 순수한 생성물을 보여주는 정제된 스펙트럼의 LCMS UV 트레이스와, 이 정제된 트라이머 피크의 정체를 확인해 주는 질량 분석 스펙트럼이 제시되어 있습니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 기능화된 bis 펩타이드를 합성하기 위해 고상 합성법을 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 연구자들이 bis 펩타이드 분야에서 단백질-단백질 상호작용 및 촉매 작용에 대한 응용 분야를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 숙달된 후 적절하게 수행한다면, 이 기술을 통해 4~5일 만에 기능화된 bis 펩타이드 삼량체를 합성할 수 있습니다.

본 절차를 수행할 때, 비드를 반응 용액 및 세척 용액에 계속 침전시켜 두는 것이 중요합니다. 입체 화학이나 다른 기능기가 단백질 결합 또는 촉매 활성에 미치는 영향과 같은 추가적인 의문점을 해결하기 위해 병렬 합성 또는 라이브러리 합성과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 유기 시약을 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행할 때는 항상 적절한 개인 보호 장구 착용 및 흄 후드 사용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.