단백질 - 단백질 상호 작용 연구를 자성 비즈를 사용하여 액상 동질 캡처 분석 : Poliovirus-Nanobody의 예

본 프로토콜은 폴리오바이러스(poliovirus)와 폴리오바이러스 인식 나노바디(Poliovirus recognizing nano bodies) 사이의 상호작용을 이용하여 간단한 정량적 액상 친화성 캡처 분석법(quantitative liquid phase affinity capture assay)을 시연합니다. 원칙적으로 코발트 코팅 자기 비드를 사용하여 태그가 붙은 단백질과 상호작용하는 모든 방사성 표지 단백질을 침전(pull down)시킵니다. 먼저, 표지된 단백질과 태그가 붙은 단백질을 혼합하고 상온에서 배양하십시오.

그 다음 태그를 인식하는 자성 비드를 첨가하고, 자석을 사용하여 표지된 단백질의 결합 분획을 비결합 분획으로부터 분리합니다. 이어서 비결합 분획에서 발견된 표지된 단백질의 신호를 측정하여 비결합 분획에 존재하는 표지된 단백질의 양을 결정합니다. 이러한 액상 친화성 분석법의 결과는 구조적 변환에 민감한 단백질을 분석할 때 매우 유용합니다.

이 액상 상 친화성 캡처 분석법은 폴리오바이러스를 인식하는 나노바디와 다양한 폴리오바이러스 항원 사이의 상호작용에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 이 방법은 한 단백질을 표지하고 다른 단백질을 검출할 수 있다는 전제하에 다른 단백질-단백질 상호작용에도 적용될 수 있습니다. 저희는 폴리오바이러스를 인식하는 나노바디와 다양한 폴리오바이러스 항원 사이의 상호작용을 조사하는 데 관심을 가졌을 때 처음으로 이 방법의 아이디어를 얻었습니다.

폴리오바이러스는 고체 표면에 부착될 때 구조적 변형에 민감하므로, e LSA의 사용이 제한적입니다. 따라서 액상 기반 시스템을 사용하는 것이 바람직합니다. 폴리오바이러스 연구에서 자주 사용되는 이러한 액상 기반 시스템의 한 예로 마이크로 단백질이 있습니다.

면역침강 분석법입니다. 이 테스트는 그 적용 가능성이 입증되었음에도 불구하고, 나노바디(nano bodies)에는 없는 기존 항체의 결정 구조를 필요로 합니다. 흥미롭고 매우 안정적인 단일 도메인 항체인 이러한 나노바디는 다양한 텍스트로 쉽게 엔지니어링될 수 있습니다.

널리 사용되는 His-tag은 니켈이나 코발트와 같은 2가 이온에 친화력을 보이며, 이러한 이온들은 자기 비드에 쉽게 코팅될 수 있습니다. 따라서 본 연구진은 코발트가 코팅된 자기 비드 기반의 간단한 정량적 친화성 캡처 분석법을 개발하였습니다.

볼텍싱으로 마그네틱 비드 스톡을 재현탁하고, 샘플당 10 µL씩 튜브에 옮긴 후 자석을 사용하여 비드를 펠렛화합니다. 비드를 세척하기 위해 투명한 상층액을 제거합니다. 결합 버퍼 150 µL를 추가합니다.

자석을 사용하여 비드를 수확하고, 2차 세척 후 상층액을 제거합니다. 대조군을 포함한 각 샘플당 40 µL의 결합 완충액에 비드를 재현탁합니다. 샘플 1의 배경값을 위해, 방사성 표지 바이러스 없이 대조군과 동일한 부피의 결합 완충액만 넣은 웰을 준비합니다.

100% 방사능 시료를 준비합니다. 나노바디 대신 결합 완충액을 사용하여 나머지 모든 성분을 웰에 첨가합니다. 이제 모든 시료에 총 부피 80 µL의 결합 완충액에 포함된 2000 cpm의 S 35 표지 poliovirus seven strain type one을 첨가합니다.

대조군을 수용합니다. 샘플 1입니다. 각 샘플에 나노바디 희석액 10 µL를 첨가합니다.

쉐이커에서 10초 동안 잘 섞은 후 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 세척된 자성 비드 현탁액 40 µL를 첨가하고 지속적으로 흔들어주며 실온에서 10분 동안 배양합니다. 자석을 이용해 비드를 펠렛화하고, 각 시료의 방사능을 측정하기 위해 맑은 상층액을 튜브로 옮깁니다. 상층액 50 µL를 계수 플라스크로 옮깁니다. 신틸레이션 액 혼합물 3 mL를 첨가하고 신틸레이션 카운터로 측정합니다.

물을 사용하여 튜브 내의 사용된 자기 비드를 역으로 끌어당겨 회수한 후 500 ×g에서 2분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 비드를 0.5 M 수산화나트륨 6 mL에 다시 현탁합니다. 그 후 현탁액을 여러 개의 튜브에 분주하고 초음파 세척기에서 5분 동안 배양합니다.

자석을 사용하여 비드를 펠렛화하고 상층액을 제거한 후, 각 튜브에 2% SDS 용액 1 mL를 첨가하고 볼텍싱과 포일링으로 5분 동안 혼합합니다. 이어서 비드를 회수합니다. 각 튜브에 0.2 M EDTA (pH 7) 1 mL를 첨가하고 초음파 세척기에서 5분 동안 배양합니다.

그런 다음 비드를 수집하고, 1 mL의 물로 3회 세척한 후 10 mM 염화 코발트 용액 1 mL로 세척합니다. 튜브를 셰이커에 올리고 10분 동안 흔들어 줍니다. 마그넷을 이용하여 비드를 회수한 후, 1 mL의 결합 버퍼에 다시 현탁합니다.

1 mL의 20% Ethanol로 두 번 세척한 후, 최종적으로 비즈를 원래 부피의 20% ethanol에 재현탁하여 40 mg/mL 농도의 재생 비즈를 얻습니다. 대조군을 설정하여 배경 방사능을 보정합니다. 대조군 시료 1을 0% 방사능 값으로, 대조군 시료 2를 100% 방사능 값으로 설정합니다.

이제 각 샘플에 대해, 나노바디에 의해 방사성 표지된 바이러스가 전체적으로 침전된 정도를 측정하기 위해 상층액 내 방사능의 백분율을 계산하십시오. 본 실험은 천연 항원, 가열 항원 및 14 s 서브유닛의 세 가지 서로 다른 폴리오바이러스 항원을 사용하여 PVSS 38 C와 폴리오바이러스 특이적 항체의 친화도를 평가합니다. 흥미롭게도, 방사성 표지된 14 s 서브유닛을 포함하는 샘플의 상층액 내 방사능은 나노바디 PVSS 38 C의 농도가 증가함에 따라 감소합니다. 이는 나노바디 PVSS 38 C, 그리고 간접적으로는 자성 비드에 결합된 폴리오바이러스 14 s 서브유닛의 양이 증가했음을 나타냅니다.

pvs S 38 C가 폴리오바이러스의 N 항원성 및 H 항원성 형태에 대해 아무런 친화력을 보이지 않으므로, 이 나노바디는 폴리오바이러스의 14 s 서브유닛에 특이적인 것으로 보입니다. 이 방법으로 측정한 나노바디의 항원 친화력은 무관한 나노바디인 NB one이 폴리오바이러스의 세 가지 항원성 형태에 대해 반응성을 보이지 않는 것과 비교했을 때 특이적입니다.

서로 다른 날에 서로 다른 연구자들이 생성한 이 용량 반응 곡선에서 알 수 있듯이, 이 시스템은 높은 재현성을 나타냅니다. 숙련된 경우, 비드의 재사용을 포함하여 이 신뢰할 수 있는 액상 친화성 캡처 분석을 2시간 이내에 적절히 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 특히 고상 기반 시스템을 사용할 수 없는 경우, 서로 다른 단백질 간의 상호작용을 연구할 때 자기 비드 기반의 액상 친화성 캡처 분석을 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.