단일 및 다세포 상황에서 Invadopodia로 인한 세포 외 기질 Proteolysis의 양적 측정

이 표준 기술은 정량적인 침습 포디움 매트릭스 분해 분석에 적합하도록 형광 표지된 젤라틴이 코팅된 커버슬립을 제작하는 방법입니다. 형광 표지된 젤라틴으로 커버슬립을 코팅한 후, 세포를 플레이팅하고 매트릭스 분해를 위해 배양합니다. 그다음, 세포를 고정하고 침습 포디아 마커 단백질을 형광 염색한 뒤 이미지를 획득하여 매트릭스 분해 정도를 정량화합니다.

전형적인 결과는 특정 유전자의 차등적 조작이나 약물 처리를 받은 세포 간의 포디아(podia) 매개 매트릭스 분해 차이를 정량화할 수 있습니다. 형광 젤라틴의 불균일한 코팅이나 젤라틴 코팅 커버슬립의 부적절한 취급으로 인해 균일한 형광을 띠는 젤라틴 코팅 커버슬립을 준비하는 것이 어렵기 때문에, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 해당 절차의 시연은 연구조교수 Karen Martin, 박사후 연구원 Mandy Ammer, 그리고 대학원생 Elise Walk, Karen Hayes, Steve Markwell이 진행합니다.

표시되지 않은 5% gelatin sucrose 스톡 용액을 준비하려면, PBS에 gelatin과 sucrose를 혼합하고 37 °C에서 완전히 용해시키십시오. 그 후 4 °C에서 보관하십시오. 이어서 유리 커버슬립을 세척하십시오.

24웰 플라스틱 조직 배양 플레이트의 각 웰에 커버슬립을 하나씩 넣고, 각 웰에 20% 질산 500 µL를 첨가한 후 30분 동안 배양합니다. 질산 용액을 제거한 후, 커버슬립을 탈이온수로 3회 세척합니다. 그 다음 코팅을 진행합니다.

각 커버슬립에 50 µg/mL 농도의 poly-L-lysine 500 µL를 처리하고 실온에서 20분 동안 배양합니다. poly-L-lysine 용액을 제거하고 PBS로 3회 세척합니다. Poly-L-lysine 코팅은 상층의 표지된 젤라틴이 균일하게 코팅되고 결합하도록 돕습니다. 24-웰 플레이트를 얼음 위에 두고, 각 웰에 갓 준비한 0.5% glutaraldehyde 500 µL를 첨가합니다.

플레이트를 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다. 차가운 PBS로 세 번 세척한 후, 젤라틴 코팅 전에 모든 PBS 흔적을 흡입하여 제거합니다. 그동안 글루타르알데히드 배양 중에 Oregon Green 488 접합 젤라틴을 재구성합니다.

제조사 프로토콜에 따라, 해당 용액과 라벨링되지 않은 5% gelatin sucrose 스톡 용액을 37 °C로 가온합니다. 그런 다음, 라벨링된 gelatin 500 µL를 라벨링되지 않은 gelatin 4 mL에 희석합니다. 희석된 4 88 gelatin 혼합액 100 µL를 각 커버슬립 위에 파이펫으로 분주합니다.

수동으로 펴 바르지 않고 커버슬립을 코팅하기에 충분한 양의 젤라틴을 사용합니다. 조기 응고를 방지하기 위해 코팅 과정 동안 희석된 4 88 젤라틴 혼합물을 37°C로 유지하는 것이 중요합니다. 또한, 이 단계부터는 잠재적인 광퇴색을 피하기 위해 커버슬립을 가능한 한 어두운 곳에 보관하십시오.

한 플레이트 내의 모든 커버슬립 코팅이 완료되면, 플레이트를 기울인 상태에서 각 웰의 과잉 젤라틴을 진공 흡입으로 제거합니다. 그다지 코팅된 커버슬립을 실온의 암소에서 10분 동안 배양합니다. 커버슬립을 PBS로 3회 세척한 후, 500 µL의 sodium burrow, hydride, sodium burrow를 첨가합니다.

수소화붕소나트륨 용액은 발포성이 있어 각 커버슬립 위와 주변에 작은 기포가 보일 것입니다. 잔류 글루타르알데하이드를 환원 및 불활성화하기 위해 실온에서 15분 동안 배양합니다. 각 웰의 외곽을 빠르게 훑어내는 진공 흡입 방식으로 수소화붕소나트륨 용액을 제거합니다. 이때 수소화붕소나트륨 처리 과정 중 조직 배양 플레이트 바닥에서 떨어져 떠오른 커버슬립이 함께 흡입되지 않도록 주의하십시오. PBS로 3회 세척한 후, 커버슬립을 70% 에탄올에 넣고 실온에서 30분 동안 배양합니다.

멸균 기술을 사용하여, 플레이트가 포함된 커버슬립을 type two A B 세포 배양 라미나 플로우 후드로 옮기고, 멸균된 바늘과 포셉을 사용하여 커버슬립을 멸균 PBS로 3회 헹굽니다. 커버슬립을 새로운 24 웰 플레이트의 빈 웰로 조심스럽게 옮긴 후, 사용할 특정 세포 유형의 배양액으로 커버슬립을 평형화합니다.

적절한 배양 시간 후, 세포를 커버슬립 위에 직접 분주합니다. 면역형광 이미징을 위해 샘플을 마운팅 처리합니다. 현미경 슬라이드 위에 prolonged gold anti fade 또는 이와 유사한 시약을 한 방울 떨어뜨리고, 뒤집힌 커버슬립을 조심스럽게 배치하여 분석을 위한 이미지를 획득합니다.

이 분석은 세포의 면적 또는 세포 수 대비 기질 분해의 정규화된 면적을 제공합니다. 이는 irna 성장 인자 또는 치료제로 집단 처리된 여러 세포가 존재하는 전체 현미경 시야를 분석하는 데 유용합니다. 이 분석을 위해서는 세포군에 대한 정보를 효율적으로 수집하기에 충분한 낮은 배율에서 획득한 이미지가 사용됩니다.

Image J에서 이미지를 엽니다. 스케일 정보를 확인하고 측정 항목을 선택합니다. Area와 Limit to threshold 옵션을 선택합니다. 배경 임계값을 차감하여 젤라틴 전체의 불균일한 조명을 보정한 후, 픽셀 강도의 상한값과 하한값을 설정하여 형광 젤라틴 이미지의 분해 영역을 계산합니다.

후속 이미지들의 경우, 임계값(threshold) 창의 set 버튼을 사용하여 모든 이미지에 동일한 임계값을 설정함으로써 분해 영역을 선택하는 객관적인 기준으로 삼습니다. 입자 분석(analyze particles) 기능을 사용하여 매트릭스 분해 영역의 임계값을 측정합니다.

선택 영역에서 노이즈를 제거하려면 0보다 큰 입자 크기를 선택하십시오. 관심 영역을 식별하기 위해 외곽선을 표시하십시오. 그런 다음, 도면에서 모든 손상 부위가 구체적으로 외곽선으로 표시되었다면 '결과 표시(display results)'와 '요약(summarize)'을 체크하여 측정값을 표시하십시오.

다른 객체(예: 부스러기)가 함께 선택되었다면 전체 면적 측정값을 스프레드시트에 복사하고, 관련 관심 영역의 면적만 기록하십시오. 다음으로 세포 면적을 계산하기 위해 foid 및 염색된 이미지를 열고, 이후 이미지에서 세포의 가장자리가 선택되도록 이미지 임계값(threshold)의 픽셀 강도 상한값과 하한값을 설정하십시오. 임계값 창의 설정(set) 버튼을 사용하여 모든 이미지에 동일한 임계값을 적용하십시오.

세포 영역을 선택하기 위한 객관적인 수단으로서, 입자 분석(analyze particles) 기능을 사용하여 세포 영역의 임계값을 측정하십시오. 선택 영역에서 노이즈를 제거하기 위해 0보다 큰 입자 크기를 선택하십시오.

분석 영역을 식별하기 위해 윤곽선을 표시하고, 표시 결과를 확인한 후 요약하여 면적 측정값을 나타냅니다. 체크하지 마십시오. 세포와 클러스터 사이에 공간이 있는 경우 구멍(holes)을 포함하십시오.

이제 선택하십시오. 관련 관심 영역의 면적 결과값을 스프레드시트로 복사하여 세포 총 면적당 젤라틴 분해 면적을 계산합니다. 다른 방법으로는 DAPI 염색된 핵의 개수를 세어 결정한 세포 수로 분해 면적을 정규화하는 방법이 있습니다.

조작으로 인해 평균 세포 면적이 변경되는 경우 이는 중요합니다. 이 접근 방식에서는 nucleus counter 플러그인을 사용하여 핵을 자동으로 계수하십시오. 이미지에 최적화되도록 옵션을 조정하십시오. 핵이 광범위하게 겹치는 경우, 자동 계수로 정확한 수치를 얻지 못할 수 있습니다.

적절하게 수행될 경우, 세포 계수 플러그인을 사용하여 수동 계수를 용이하게 할 수 있습니다. 커버슬립은 Oregon Green 488이 접합된 젤라틴으로 고르게 코팅됩니다. 젤라틴 코팅 커버슬립의 코팅 및 처리 과정 중에 여러 아티팩트가 발생할 수 있습니다.

예를 들어, 혼합 불량, 수동 도포 또는 젤라틴 혼합물의 부분적 응고로 인해 코팅 과정 중 커버슬립이 적절히 덮이지 않으면 코팅이 불균일하게 됩니다. 긁힌 자국은 취급 과정에서 바늘이나 포셉으로 인해 코팅된 매트릭스가 제거되었음을 나타냅니다. 장기간 보관 시 커버슬립 표면이 건조되면 자갈 모양(cobblestone appearance)이 나타날 수 있습니다. 이 영역은 장시간 또는 고강도의 빛에 노출되어 이미징 중에 형광 젤라틴 표면의 광퇴색(photo bleaching)이 일어났음을 반영합니다.

잘 준비된 커버 슬립을 현미경으로 관찰했을 때 균일한 형광이 나타나는지 확인하십시오. 이 과정을 통해 제작된 얇은 매트릭스는 세포의 ECM 분해 능력을 평가하는 민감한 수단이 됩니다. 예를 들어 다음과 같습니다.

이 이미지들은 OSC 19 두경부암 세포의 침습적 포디움 매트릭스 분해 활성을 포착한 것입니다. 여기서 세포들은 Oregon Green 4 88이 결합된 젤라틴 커버슬립 위에 배양되었으며, 2D 및 3D 이미지로 나타낸 형광 현미경으로 촬영되었습니다. Oregon Green 4 88 결합 젤라틴 커버슬립에 배양된 이 OSC 19 세포들은 Rhodamine 결합 Phalloidin과 anti-cortactin 항체로 라벨링되었으며, ANOR 647 2차 항체로 시각화하여 침습된 부분을 녹색으로 가색하였습니다.

병합된 이미지에서 포디아(podia)는 F actin 및 cortactin이 세포질에 국소적으로 농축되어 gelatin clearing volume fill 영역과 겹치는 형태로 나타납니다. 시각화 자료는 침투한 포디아가 ECMA 하부 부피로 어떻게 뚫고 들어가는지를 보여주며, 침투 포디아가 존재하는 세포 내부의 가장자리를 보여주기 위해 해당 부피가 생성되었습니다. 등측 가장자리 뷰(dorsal edge view)는 하부 gelatin에 삽입된 침투 포디아를 보여줍니다.

복측 가장자리 뷰에서 Veda podia의 돌출부와 커버슬립 아래의 젤라틴 분해 영역이 녹색 매트릭스 상의 적색 영역으로 나타납니다. 이 이미지들은 전체 현미경 이미지 내에서 정규화된 젤라틴 매트릭스 분해 세포를 정량화하기 위한 주요 단계 중 일부를 보여줍니다. 적색 임계값 설정 및 관심 영역 표시를 더 명확하게 나타내기 위해 모든 형광 이미지는 그레이스케일로 변환되었습니다.

Oregon Green 488이 접합된 젤라틴의 이 이미지는 분해가 일어난 어두운 영역을 보여줍니다. 임계값 설정(Thresholding)을 통해 젤라틴 이미지에서 분해된 영역이 강조되며, 이 중 선택된 관심 영역을 통해 분해 면적을 측정합니다. 이 이미지는 예상대로 rumine, foid 및 f actin의 염색 상태를 보여줍니다.

actin 이미지의 임계값(threshold)은 측정할 세포 영역을 선택하는 기준이 되는 전체 세포 영역을 강조하여 보여줍니다. 마찬가지로, 이 기술은 DAPI로 염색된 세포핵 이미지를 연구하는 데에도 적용될 수 있습니다. 이 패널은 혼합 세포군 내 개별 세포에 의한 형광 젤라틴 분해 정도를 정량화하는 과정 중 주요 단계를 보여줍니다.

이 간단한 정량 분석은 flag 에피토프 태그가 융합된 재조합 cort actin을 과발현시키는 단일 형질전환 OSC 19 세포를 대상으로 한 것입니다. 형질전환된 세포에 의한 매트릭스 분해는 형질전환 세포와 비형질전환 세포가 섞여 있는 혼합 집단 내에서도 분석 가능하다는 점에 유의하십시오. 이 절차를 수행할 때 다음 몇 가지 사항을 기억하는 것이 중요합니다.

먼저, 형광 세포 마커가 형광 젤라틴의 색상과 겹치지 않는지 확인하십시오. 이미지를 수집할 때, 세포의 존재 여부를 기준으로 시야를 선택하는 것이 중요합니다. 세포주 간의 변동성과 다양한 치료제에 대한 반응으로 인해 데이터에 편향이 생길 수 있으므로, 분해된 영역만 선택적으로 탐색하지 마십시오.

좌석 수(seating number), 분해 시간 및 면역형광 표지를 위한 단백질 선택과 같은 요인들은 귀하의 특정 실험에 맞게 최적화되어야 합니다. 이 영상을 시청한 후에는 beta podia 매개 분해 분석을 통해 형광 젤라틴이 균일하게 코팅된 커버슬립을 제작하는 방법과 매트릭스 분해량을 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.