전체 세포 인구의 단일 셀 수준에서 Cyclin B의 Proteolysis 유학

본 절차의 목적은 cycling B의 단백질 분해가 후기 시작과 유사분열 종료를 어떻게 조절하는지 모니터링하는 것입니다. 이를 위해 먼저 microscopy 슬라이드에 cycling B snap reporter 세포를 분주합니다. 두 번째 단계는 chimeric Cyclin B snap reporter 분자를 형광 기질인 TMR star로 표지하는 것입니다.

다음으로, 현미경 스테이션에서 이미지 시리즈를 획득합니다. 마지막 단계는 세포를 분석하고 시간에 따른 TMR star 형광 강도를 계산하는 것이며, 이는 cycling B 단백질 분해를 반영합니다. 궁극적으로, 살아있는 리포터 세포의 면역형광 현미경 관찰을 통해 유사분열 중에 일어나는 cycling B 단백질 분해의 역학을 밝혀낼 수 있습니다.

cyclone B GFP 모니터링과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, cyclone B SNAP을 통해 전체 단백질 발현이 아닌 cyclone B의 분해 과정을 모니터링할 수 있다는 점입니다. 본 실험을 위한 snap 리포터 세포는 우선 로그 성장기에서 최소 48시간 동안 비동기적으로 성장하도록 합니다. 시작 단계로, 챔버 원심분리기 표면 전체에 세포가 균일하게 분포되도록 8-웰 현미경 챔버에 sub confluence 상태의 snap 리포터 세포를 분주하기 위한 트립신 처리 과정을 수행합니다.

10,000개의 세포를 페놀 레드(phenol red)가 없는 일반 성장 배지 350 µL에 현탁합니다. 세포 현탁액을 현미경 챔버로 옮겨 8웰 현미경 챔버에 세포를 파종하며, 이때 챔버 중앙의 세포 밀도가 최대가 되도록 합니다. 먼저 챔버에 페놀 레드(phenol red)가 없는 일반 성장 배지 300 µL를 채웁니다.

다음으로, 96-웰 특수 광학 플레이트의 웰 전체 표면에 걸쳐 세포를 일정하게 분포시켜 시딩하기 위해 5,000개의 세포를 현미경 챔버 중앙에 조심스럽게 첨가합니다. 필요한 세포 함유 웰의 총 개수에 따라 5,000개의 세포를 원심 분리하고 300 µL의 페놀 레드 프리 일반 성장 배지에 재현탁합니다. 세포 수와 현탁 배지의 총 부피를 조절하십시오.

그 다음, 웰 중심부에 최대 세포 밀도를 형성하며 세포를 파종하기 위해 세포 현탁액을 96웰 플레이트로 옮깁니다. 페놀 레드(phenol red)가 없는 일반 성장 배지 15 µL에 1,500개의 세포를 넣어 각 웰의 중심부에 작은 방울 형태로 조심스럽게 첨가합니다.

이렇게 하면 세포 성장이 웰의 중앙으로 제한됩니다. 염색 절차를 시작하기 30분 전까지, 모든 파종된 세포를 표준 세포 배양 조건에서 최소 18시간 동안 배양하십시오. 페놀 레드(phenol red)가 없는 일반 성장 배지를 37 °C로 예열하십시오.

본 시연에서 사용되는 snap 기질은 취급이 용이한 TMR star입니다. DMSO에 TMR star를 녹여 400 micromolar 농도의 스톡 용액을 제조하십시오. TMR star 스톡 용액 0.5 microliters를 phenol red가 없는 따뜻한 일반 성장 배지 200 microliters에 희석하여 최종 표지 농도가 1 micromolar가 되도록 합니다. 다음으로, 비동기적으로 성장하는 세포에서 일반 성장 배지를 제거하고 표지 배지로 교체하십시오. 표준 배양 조건 하에 세포를 표지 배지에서 25분 동안 배양합니다.

25분 후, 라벨링 배지를 제거하고 따뜻한 phenol red free 일반 성장 배지로 세포를 4회 세척합니다. 마지막 세척 후, 현미경으로 옮기기 전 따뜻한 phenol red free 일반 성장 배지 300 microliters에서 세포를 30분 동안 배양합니다. 결합되지 않은 잔류 snaps 기질을 제거하기 위해 배지를 신선하고 따뜻한 phenol red free 일반 성장 배지로 교체합니다. 37 degree Celsius로 예열된 히팅 블록이 담긴 스티로폼 상자에 넣어 세포를 현미경으로 운반합니다.

형광 강도를 측정하기 2시간 전에 온도 변화를 최소화하십시오. 현미경과 모든 구성 요소를 원하는 온도에 도달시키기 위해 클라이밋 챔버의 공기 온도를 건조 모드에서 37 °C로 조절하십시오. 응결로 인해 현미경이 손상되는 것을 방지하려면 습도를 설정하기 전에 예열하는 것이 중요합니다.

현미경 시스템 전체가 37 °C에 도달하면, 공기 습도를 60%로, 이산화탄소를 5%로 조정하십시오. 스캔 또는 획득 소프트웨어를 시작하고 표준 설정을 정의합니다. 분석할 웰의 위치를 지정하십시오. delta T 또는 획득 주기 시간과 절대적인 획득 주기 횟수를 정의하십시오.

본 시연에서는 더 많은 수의 웰을 분석하기 위해 하드웨어 자동 초점(autofocus)이 미리 선택되어 있습니다. 획득을 시작하고 처음 두 번의 획득 사이클을 모니터링하십시오.

현미경은 histone H2 GFP 신호에 초점을 맞추고 해당 채널에서 첫 번째 이미지를 획득한 후, 필터를 변경하여 그에 해당하는 TMR star 이미지를 획득합니다. 이 과정은 웰 내의 모든 위치와 분석 대상인 각 웰에 대해 반복되며, 이후 다음 사이클이 다시 반복됩니다. 단백질 분해 프로파일을 분석하려면 scan R 분석 소프트웨어를 실행하십시오.

신호 강도 기반의 임계값과 인접한 세포의 분리를 돕는 watershed 알고리즘을 사용하여, histone H2 GFP로 시각화된 세포핵을 메인 객체로 정의하여 이미지를 분석하십시오. TMR* 분석을 위해 세포질을 포함하는 핵으로 구성된 하위 객체를 생성해야 합니다. 메인 객체의 중요한 속성은 X 및 Y 좌표, 시간, GFP의 최대 및 평균 강도, 그리고 면적으로 나눈 총 강도입니다.

TMR star 하위 객체의 경우, 추적 모드로 변경하여 시간 경과에 따른 하위 객체의 평균 TMR star 형광 강도 또는 분석된 주 객체에 할당된 세포 추적선을 시각화하십시오. 더 많은 수의 세포를 관찰하면 대표적이고 객관적인 초기 뷰를 얻을 수 있으나, 최소 140 cycle 동안 지속되고 최대 histone H two GFP 강도가 높은 측정값들만 게이팅하여 검토할 세포 수를 좁힐 수 있습니다. 관심 있는 세포 추적선을 선택하여 단일 세포 수준에서 histone H two GFP와 TMR star 형광을 동시에 시각화하십시오.

마우스 오른쪽 버튼을 사용하여 관심 세포를 클릭하고 내보낼 수 있는 이미지를 생성합니다. 매 시점의 histone H2 GFP 및 cycling B snap TMR star를 예시하는 갤러리입니다. 스캐너 분석 소프트웨어를 인구 집단 모드로 변경하고, 도트 블롯(dot blot) 상에서 관심 세포가 표시되는 영역을 게이팅합니다.

게이팅된 영역에 새로운 점 도표(dot plot) 창을 적용하고 시간에 따른 평균 TMR star 형광 강도를 시각화합니다. 추가 계산을 위해 데이터를 Microsoft Excel로 내보냅니다. 여기의 도표는 Cyclin B의 역학을 나타내며, 빨간색 삼각형으로 표시된 핵막 붕괴(nuclear envelope breakdown 또는 NEBD) 이후 세포질 응축 시 염색체 정렬 오류 징후 없이 정상적인 유사분열을 진행하는 세포의 TMR star 형광 강도 곡선으로 표현되었습니다. TMR staph 형광 강도는 등형 창(isomorphic window)에 도달할 때까지 급격히 증가하는 양상을 보입니다.

세포가 전중기(prometaphase)에 진입하면 형광 강도는 세포가 전기(prophase)와 중기(metaphase)를 지나는 동안 안정적인 수준을 유지하다가 이후 급격히 감소하기 시작합니다. 모든 염색체가 안정적인 중기판(metaphase plate)을 형성하고 나면, 이러한 감소는 염색체 분리보다 먼저 일어납니다. 분열 후기(late mitosis) 곡선의 파란색 점으로 표시된 후기(anaphase) 동안, 염색질은 응축이 해제되기 시작하며 세포는 후기 형태를 띱니다.

형광 강도 곡선이 고원에 도달하며, 이는 유사분열 전의 고원보다 낮은 수준입니다. 이 기술은 유사분열 분야의 연구자들이 유사분열 진행을 조절하는 사이클린의 분해와 합성 사이의 정밀한 균형을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.