가스 크로마토 그래피에 의한 operant 에탄올 자기 관리 및 에탄올 결정시 에탄올의 Microdialysis

본 절차의 전체적인 목표는 에탄올 자가 투여 세션 동안 뇌 투석액 내의 에탄올 수치를 모니터링하는 것입니다. 이 측정값을 동시적인 자가 투여 행동과 비교하기 위해, 먼저 미세투석 가이드, 캐뉼라 및 테더 볼트를 외과적으로 이식한 다음, 쥐가 에탄올을 조작적으로 자가 투여하도록 훈련시킵니다. 두 번째 단계는 쥐를 헤드 스테이지 테더에 적응시켜 미세투석 중에 에탄올 자가 투여가 방해받지 않도록 하는 것입니다.

그 다음, 에탄올 자가 투여 세션 동안 마이크로다이얼리시스를 수행하며, 분석을 위해 다이얼리세이트의 일부를 준비합니다. 이어서, 불꽃 이온화 검출기가 장착된 가스 크로마토그래피를 사용하여 다이얼리세이트 샘플의 에탄올 농도를 분석합니다. 최종적으로, 얻어진 결과는 에탄올 자가 투여 세션 중 관심 뇌 영역에 도달하는 에탄올의 시간 경과를 보여줍니다.

꼬리 또는 복재정맥 천자와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 샘플 수집 시의 방해가 최소화되며, 동물이 행동 과제를 수행하는 동안 관심 뇌 영역 내의 약물 농도를 시간에 따라 측정할 수 있다는 점입니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 사람은 여러 가지 전문적인 기술이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있으며, 이러한 기술 중 상당수는 반복적인 연습이나 경험을 통해서만 습득할 수 있습니다. 본 절차의 시연은 저희 연구실의 학부 연구 보조원인 Jeffrey Dilley가 진행하겠습니다.

제시된 모든 동물 실험 절차는 텍사스 대학교 기관동물관리사용위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았으며, 실험동물의 관리 및 사용에 관한 모든 지침 및 규정을 준수하였습니다. 텍사스 대학교 오스틴 캠퍼스는 ALAC 인증 시설이며, 본 행동 미세투석 실험에는 관심 뇌 영역 상부에 21 gauge 캐뉼라를 외과적으로 이식한 Long Evans 쥐가 사용되었습니다. 모든 동물은 다음 절차를 시작하기 전, 최소 1주일 이상의 수술 후 관리 및 회복 기간을 거쳐 건강한 상태여야 합니다.

Lichter retractable lever와 tipper tube가 장착된 Med Associates 조작 챔버에 쥐를 넣고, 10% sucrose 용액을 섭취하기 위해 레버를 누르도록 훈련시킵니다. 쥐가 sucrose 용액에 반응하도록 훈련되면, 마지막에서 두 번째 조작 세션 전날 밤부터 여러 차례의 음수 세션에 걸쳐 용액에 ethanol을 점진적으로 추가하는 적절한 훈련 스케줄을 시작합니다. 동물을 마취하고 진정 수준을 확인한 후, 균형추 레버, 암(arm), swivel tether, 스프링 및 링 스탠드로 구성된 장치에 적응시키기 위해 쥐의 헤드 스테이지에 있는 tether bolt에 tether spring을 연결합니다.

마이크로다이얼리시스 실험 전날, 쥐를 홈 케이지에 넣어 먹이와 물, 그리고 ad lido와 함께 오퍼런트 룸에서 하룻밤을 보내게 한 후, 테더와 관련 장비를 장착한 상태에서 다음 날의 훈련 세션을 완료합니다. isof fluorine으로 쥐를 마취시킨 후, 발가락 꼬집기(toe pinch)를 통해 진정 상태를 확인하고 인공 뇌척수액이 관류되는 마이크로다이얼리시스 프로브를 삽입합니다. 프로브를 적절하게 고정한 다음, 프로브 유량을 0.2 microliters per minute로 조정합니다.

모든 투석 장비를 설치한 상태에서 쥐를 조작실 내의 홈 케이지에 넣어 하룻밤을 보내게 하고, 먹이와 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 합니다. 프로브를 삽입한 다음 날, 실험 시작 최소 2시간 전에 프로브를 작동 유량으로 높입니다. Hamilton 시린지를 사용하여 프로브 유량이 일정하며 설정 유량의 최소 90%인지 확인합니다.

투석 샘플에서 신경전달물질을 평가하는 경우, 실험의 모든 단계에서 샘플을 채취하십시오. 동물이 홈 케이지에 있을 때 투석 샘플을 수집하는 것부터 시작하십시오. 이후 분석을 위해 샘플을 적절한 방법으로 보관하십시오.

쥐를 조작 챔버로 조심스럽게 옮기고 챔버를 제어하는 조작 프로그램을 시작합니다. 레버가 챔버 내부로 확장되기 전까지 2회 분량의 샘플을 계속 채취하며 쥐가 대기하도록 합니다. 투석액의 적절한 분량을 2 mL 유리 바이알에 피펫으로 옮기고 기밀 격막으로 바이알을 밀봉하여 에탄올 분석을 위한 투석액 샘플 일부를 수집하기 시작하며, 에탄올 샘플은 신속하게 피펫팅하여 밀봉합니다.

에탄올은 휘발성이고 시료의 부피가 작기 때문에, 시료 준비 과정이 일관되지 않거나 느리면 결과가 부정확해질 수 있습니다. 남은 양은 신경전달물질 분석을 위해 보관하십시오. 20분간의 음수 기간은 Med Associates 컴퓨터 프로그램이 레버를 챔버 안으로 밀어 넣고, 쥐가 이를 눌러 음용액 병에 접근했을 때부터 시작됩니다.

음용 기간 내내 계속해서 시료를 채취하십시오. 음용 기간이 끝나면 컴퓨터 프로그램이 챔버에서 병을 회수합니다. 마이크로다이얼리시스 실험 종료 후, 동물은 챔버 내에서 20분 동안 추가적인 음용 후 기간(post drink period)을 갖도록 유지하십시오. 쥐를 마취시킨 후 프로브를 제거하십시오.

동물을 즉시 인도적으로 안락사시키지 않는 경우, 프로브 경로의 시각화를 보장하기 위해 폐쇄기를 다시 장착하십시오. 실험 후 3일 이내에 뇌를 채취하십시오. 50 °C로 가열된 헤드스페이스 오토샘플러, 헬륨을 이동상으로 사용하는 모세관 컬럼, 그리고 불꽃 이온화 검출기가 장착된 가스크로마토그래프를 사용하여 외부 에탄올 표준물질과 함께 시료를 분석하십시오.

크로마토그램을 기록하고 분석하기 위해 크로마토그래피 워크스테이션 소프트웨어를 사용하여 에탄올 분석을 위한 시스템 준비를 수행합니다. 순환 수조를 사용하여 오토샘플러 플레이트를 가열하고 공기 및 수소 탱크를 엽니다. 그다음, 시작 프로그램을 실행합니다.

준비가 되면 20분간 연소시켜 파이버를 오염 제거합니다. 100 mL 부피 플라스크를 사용하여 238 µL의 95% ethanol을 물로 희석하여 최종 부피 100 mL의 표준액을 제조합니다. 1:1 연속 희석을 통해 표준액 시리즈를 만듭니다.

표준물을 유리 바이알에 피펫으로 분주하고 샘플을 준비한 것과 동일하게 밀봉하십시오. 표준물과 함께 워터 블랭크(water blank)를 반드시 실행하십시오. 표준물과 샘플을 오토샘플러 트레이에 넣고, 모든 액체 분주액이 기화될 때까지 가열하십시오.

표준물질과 시료를 분석하려면, 어떤 시료가 오토샘플러의 어느 슬롯에 있는지 기록하고 각 시료를 천공해야 함을 명시한 시료 목록을 작성하십시오. 데이터 파일을 지정된 폴더로 경로 설정한 후, 시료에 적합한 분석 방법을 선택하고 분석을 시작하십시오. 시스템이 모든 시료의 분석을 완료하면, 프로그램이 각 피크를 정확하게 적분했는지 확인하십시오.

각 알려진 외부 표준물질의 함수로 피크 높이를 도식화하십시오. 에탄올 농도입니다. 점들로 주어진 선형 함수를 사용하여 각 투석액 샘플의 에탄올 농도를 보간하십시오.

이 그림은 세 가지 농도의 에탄올 표준물질과 에탄올 자가 투여 세션 종료 시 수집한 쥐의 투석액 샘플 한 개에 대한 예시 크로마토그램을 보여줍니다. 에탄올 피크는 비교적 대칭적이어야 하며, 일관된 머무름 시간을 가져야 하고 신호 대 잡음비가 10보다 커야 합니다. 이러한 기준을 충족하지 못하는 경우 시스템 유지보수가 필요함을 의미하며, 고품질의 크로마토그래피와 정확한 표준물질은 선형 표준 곡선을 생성하여 자가 투여 과정 동안 에탄올 자가 투여 동물로부터 수집한 투석액 샘플의 에탄올 농도를 계산하는 데 사용됩니다.

산출된 투석액 내 에탄올 농도는 생체 내 프로브 회수율이 보정되지 않은 값이며, 뇌 조직 내 에탄올 농도의 일부에 불과합니다. 에탄올의 정량적 미세투석이 필요한 경우, 세포외 공간에서 프로브로 확산되는 에탄올의 추출 분율을 실험적으로 결정해야 합니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 약 4~5시간 내에 완료할 수 있습니다.

이는 행동 세션의 길이에 따라 달라질 수 있습니다. 실험의 마이크로다이얼리시스 단계의 성공적인 완료는 준비 단계의 품질에 크게 좌우됩니다. 이 절차를 시도하는 동안 쥐를 능숙하게 다루고, 다이얼리시스 실험 중에 발생할 수 있는 모든 주의 산만 유발 자극에 쥐를 적응시켜 동물의 자가 투여 행동이 영향을 받지 않도록 하는 것이 중요합니다.