온칩 내피 염증성 Phenotyping

본 영상의 목적은 혈관 내피세포의 염증 상태를 특성화하기 위한 랩온어칩(lab on a chip) 기술을 시연하는 것입니다. 먼저, 인간 대동맥 내피세포를 조직 배양 기질 위에서 합류(confluence)될 때까지 배양한 다음, Conan 플레이트 전단 장치에 삽입합니다. 세포를 전염증성 사이토카인인 TNF alpha로 처리함과 동시에, 기질 위의 콘 회전을 정밀하게 제어하여 4시간 동안 서로 다른 전단 응력 조건에 노출시킵니다. 전단 응력은 사이토카인에 대한 잘 알려진 염증 반응을 조절합니다.

여기에는 VCAM-1 및 ICAM-1과 같은 접착 분자의 상향 조절이 포함됩니다. 기질을 현미경 스테이지로 옮긴 후, APDMS 미세유체 장치를 단층 위에 직접 진공 밀봉하여 유로를 생성합니다. 활성화된 단핵구인 THP-1 세포를 전처치된 hEC 위로 흐르게 하면, 세포 접착 분자의 발현 수준에 비례하여 세포가 결합하게 됩니다.

혈관 내피세포의 염증 상태는 강력하게 부착된 THP-1 세포의 총 수를 정량화하여 결정합니다. 안녕하세요, 저는 She D Diverse이고, 저는 Greg Foster입니다. 그리고 저는 Keith Bailey입니다.

우리는 캘리포니아 대학교 데이비스 캠퍼스 생체 의공학과의 Pastor 교수와 Simon 교수의 연구실에 있습니다. 오늘은 혈관 내피 기능 장애와 염증을 정량적으로 조사하기 위한 랩온어칩(lab-on-a-chip) 기반 접근법의 활용 방법을 설명하겠습니다. 이러한 도구들은 대사성 스트레스와 유체역학적 요인의 중첩, 그리고 내피 염증 표현형의 조절 및 죽상동맥경화증에 대한 민감성과 관련된 연구를 수행할 수 있는 플랫폼을 제공합니다.

따라서 당사는 이 장치를 혈관 모사 미세유체 챔버 또는 vmmc라고 부릅니다. 이 장치를 통해 죽상경화성 혈관과 유사한 조건에서 혈관 내피 세포와 단핵구의 염증성 결과를 정량화할 수 있습니다. VMMC를 사용하면 공급량이 제한적일 수 있는 소량의 시약이나 재료를 효율적으로 사용할 수 있습니다.

또한 이를 다양한 맞춤형 레이아웃과 기하학적 구조로 제작할 수 있어 매우 광범위한 응용 분야에 적합합니다. 오늘은 랩온어칩(lab on a chip) 방식을 이용한 대표적인 실험을 시연하겠습니다. 인간 혈관 내피 세포 단일층을 잘 정의된 전단 응력 하에서 사이토카인 활성화에 노출시킬 것입니다.

우리는 내피세포 활성화의 기능적 리드아웃으로서 단층으로 모집되는 인간 단핵세포의 양을 실시간으로 정량화하기 위한 VMC의 사용법을 시연할 것입니다. 선반을 사용하여 100mm 조직 배양 접시로부터 3인치 원형 기판을 가공합니다. 3인치 기판을 증류수로 세척한 후, 70% ethanol에 담가 멸균합니다. 멸균된 기판을 100mm 페트리 접시에 넣고 건조시킵니다.

그 다음, 100 µg/mL 농도의 1형 콜라겐과 함께 상온에서 1시간 동안 배양한 후 PBS로 세척합니다. 인간 대동맥 내피세포(HA)를 650,000 cells/mL 농도로 현탁합니다. 1 mL의 세포 현탁액을 건조된 콜라겐 코팅 기판 위에 방울 형태로 떨어뜨린 후, 고르게 펴 바릅니다.

그 후, 분주된 기질을 37 °C, 5% CO2 인큐베이터에 넣어 기질 표면에 부착되도록 합니다. 1시간 후, 9 mL의 EGM-2 성장 배지를 첨가하고 세포가 단층으로 성장하도록 하며, 약 90%의 합류도(confluency)에 도달하면 이후의 전단 실험에 사용할 수 있습니다. 혈관 모사 미세유체 챔버는 원하는 채널 기하학적 구조가 포함된 마스터 폼 위에 PDMS를 부어 제작합니다.

실리콘 베이스를 플라스틱 웨이 보트에 부은 후, 무게 대비 10:1 비율로 실리콘 경화제를 첨가합니다. 그 다음 PDMS 겔을 잘 혼합하는데, 이때 웨이 보트의 측면을 긁어 플라스틱 칩이 혼합물에 들어가지 않도록 주의합니다. 포토레지스트 마스터를 헥산으로 세척하여 VMMC 성형을 준비합니다.

그 다음 PDMS 혼합물을 마스터 몰드 위에 붓고 진공 챔버에 넣습니다. 챔버 내에서 15분 후 PDMS 혼합물로부터 공기가 제거되어 표면으로 떠오릅니다.

몰드를 챔버에서 제거하고 PDMS 표면에 공기를 부드럽게 불어 넣어 몰드에 남아 있는 기포를 제거합니다. 그 다음 몰드를 덮어 37 °C 오븐에 1시간 동안 넣어 PDMS를 경화시킵니다. 응고된 PDMS 젤을 오븐에서 꺼내고 소형 메스를 사용하여 챔버 주변으로 원형 절개를 합니다.

마스터 몰드가 손상될 수 있으므로, 포토레지스트 물질과 접촉하지 않도록 이 과정을 점진적으로 수행하는 것이 매우 중요합니다. 19게이지 루어락 니들을 사용하여 각 채널의 몰드 펀치 입구 및 출구 포트로부터 마이크로유체 챔버를 절개하십시오. 또한 채널과 떨어진 위치에 진공 튜브를 위한 구멍을 뚫으십시오.

VMMC 준비가 완료되었습니다. 6 mL의 L 15 배지에 염증성 사이토카인 TNF alpha를 피펫팅하여 최종 농도가 0.5 ng/mL가 되도록 합니다. L 15 배지는 5% CO2가 없는 환경에서도 pH 완충 능력이 있기 때문에 여기서 전단 유체로 사용됩니다.

그 후 배지를 멸균된 10 milliliter 주사기로 흡입하여 전단 장치에 주입합니다. 이어서, 에탄올로 멸균하고 수평을 맞춘 뒤 원뿔 틈새 높이를 설정한 세포 전단 장치로 밀집된 단일층을 옮깁니다. 기질을 페트리 접시에서 분리하여 유리 게이지 블록 위에 놓은 후, 원뿔이 세포 바로 위에 위치하도록 하우징 챔버 바닥 중앙에 조심스럽게 삽입합니다.

기판은 게이지 블록 주변의 스테인리스 스틸 나사를 균일하게 조여 고정합니다. 그 다음, 공기 방울이 유입되지 않도록 주의하며 전단 매질을 챔버에 채웁니다. 이어서 컴퓨터를 사용하여 원하는 전단 응력 프로그램을 입력하고 마이크로 서보 모터를 작동시킵니다.

여기서는 0 ± 5 dyn/cm²의 진동 전단력을 이용합니다. 4시간 후, 전단 프로그램을 중단합니다. 게이지 블록을 제거하고 기판을 조심스럽게 페트리 접시에 다시 넣습니다.

이제 세포가 단핵구 부착 분석을 위한 준비가 되었습니다. 전단력 가함 직후, HA 단층을 현미경 스테이션으로 운반하여 VMMC를 조립합니다. VMMC를 진공 호스에 연결하고 탈이온수에 담가 채널 내부에 갇혀 있는 기포를 제거합니다.

진공 밸브가 꺼진 상태에서 챔버를 단층 세포층 위에 조심스럽게 누른 다음 진공 밸브를 켭니다. 이때 챔버의 채널 내에 기포가 갇히지 않도록 하는 것이 매우 중요합니다. 이제 19 Gauge lure Lock 바늘의 팁을 잘라 만든 리저버에 칼슘과 마그네슘이 포함된 HBSS 80 µL를 피펫팅합니다. 리저버의 상단을 세게 눌러 팁 밖으로 용액을 밀어낸 후, 이를 VMMC의 유입구 포트에 삽입합니다.

전체 장치를 현미경 스테이지 위에 놓고 현미경 카메라와 비디오 모니터를 켭니다. 10 milliliter 유리 주사기를 주사기 펌프에 장착합니다. 다음으로, 주사기 튜브를 VMMC의 배출구 포트에 연결합니다.

유속은 채널 내에 1 dine/cm²의 전단 응력을 유도하도록 설정하며, 시린지가 리저버로부터 채널을 통해 유체를 끌어오는 리필 모드로 작동시킵니다. SDF-1로 자극된 T 세포는 2 million cells/mL 농도로 부유시킵니다. 흐름이 활성화된 후 2분 이내에 50 µL의 세포 부유액을 리저버에 추가합니다.

다시 한번, 유량이 완전히 발달했을 때 기포가 유입되지 않도록 주의합니다. 비디오는 초당 3프레임으로 캡처하며, 데이터는 Image J 소프트웨어를 사용하여 산출합니다. 부착성 THP-1 세포는 10초 동안 세포 직경의 1/2 이하로 이동하는 것으로 정의합니다.

여기에서 우리는 TNF alpha로 자극하고 15 dynes/cm²의 일정한 고전단 응력 또는 0 ± 5 dynes/cm²의 진동 전단 응력 조건 하에 둔 ha 단층에 THP-1이 부착되는 데이터를 보여줍니다. 진동 전단 응력 조건의 ha 단층은 고전단 응력을 경험한 단층에 비해 TP-1 세포 모집이 3배 더 높게 나타났습니다. 오늘 우리는 죽상동맥경화증의 기저가 되는 초기 염증 반응에 대한 중요한 통찰을 제공하기 위해 결합하여 사용할 수 있는 맞춤형 인비트로(in vitro) 기술의 활용법을 제시합니다. 구체적으로, 우리는 명확하게 정의된 유체역학적 조건 하에서 염증성 자극에 노출된 세포 및 내피 기능 장애와 관련된 결과물을 정량화합니다.

VMM CS를 사용하면 내피세포와 백혈구의 부착 상호작용의 기저에 있는 특정 기전을 조사할 수 있습니다. 또한 이러한 장치는 유연하고 비용이 저렴하다는 장점이 있으며, 인체 유래 혈청 성분과 같이 공급이 제한적일 수 있는 재료의 사용을 용이하게 합니다. 이 장치를 적용한 본 연구에는 내피세포에서 사이토카인, 지질 및 rage로 유도된 염증에 대한 조사가 포함되었습니다.

우리는 또한 여러 백혈구 유형뿐만 아니라 전혈에서 부착 메커니즘을 조사하는 온칩 분석법을 개발했습니다. 궁극적으로, 우리는 이 기술이 염증 매개 심혈관 질환의 개인별 위험도를 평가하기 위한 ex vivo 접근법으로 이어질 것으로 기대합니다.