외부 응용 직류 전기 분야에 신경 전구체 세포 마이그레이션 속도론 분석을위한 Galvanotaxis 분석

이 실험 절차의 전반적인 목적은 직류 전기장 존재 하에서 성체 유래 신경 전구 세포의 이동을 시각화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 성체 생쥐로부터 뇌실하구역 신경 전구 세포를 분리하여 배양합니다. 다음 단계로는 Galvan Axxis 챔버를 준비하고 신경 전구 세포를 해당 챔버로 옮깁니다.

마지막 단계는 Galvan Axxis 챔버에 직류 전기장을 가하고 타임랩스 이미징을 수행하여 신경 전구세포의 이동을 관찰하는 것입니다. 궁극적으로, 타임랩스 이미징 현미경은 분화 및 미분화 상태에 있는 신경 전구세포의 갈바노택틱(galvanotactic) 특성을 포착합니다. 이 방법은 신경 전구세포의 갈바노타시스(galvanotaxis)에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 신경 재생을 촉진하기 위해 병변 부위로 신경 전구세포를 모집하는 마우스 뇌졸중 모델과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.

본 절차의 시연은 저희 연구실의 대학원생인 Rob Pilley Post가 진행하겠습니다. 이 절차를 시작할 때, 부유 상태의 일차 신경구(primary neurospheres)를 수확할 준비가 되도록 NPC를 7일 동안 배양해야 합니다. 필요 시, 정사각형 유리 3개를 배치하여 Galvan Axxis 챔버 3개의 준비를 시작하십시오.

첫째, 커버슬립을 6N 염산이 담긴 병에 넣고 하룻밤 동안 담가 둡니다. 다음 날 이른 아침, Matrigel을 얼음 위에서 천천히 해동하도록 준비합니다. 4시간 후면 챔버를 제작하는 데 사용할 수 있습니다.

먼저, 다이아몬드 팁 유리 절단기를 사용하여 새 정사각형 유리판에서 6개의 직사각형 유리 스트립을 절단합니다. 첫째, 커버슬립을 준비합니다. 산 세척된 정사각형 슬립과 직사각형 슬립을 라미나 플로우 후드(laminar flow hood)로 옮깁니다.

유리 스트립을 70% ethanol로 세척한 다음, 조직 배양 등급의 오토클레이브 멸균수로 세척합니다. 이를 공기 중에서 건조시키거나 보풀 없는 종이 위에서 건조합니다. 다음으로, 각 정사각형 유리 슬라이드의 한쪽 면 테두리에 진공 그리스를 바르고 60 millimeter 플라스틱 바닥에 밀봉하여 고정합니다.

페트리 접시. 직사각형 유리 스트립의 한쪽 면에 진공 그리스를 바르고 이를 정사각형의 반대쪽 가장자리에 밀봉합니다. 각 접시 중앙에 중앙 홈이 있는 정사각형을 만들기 위해 유리 슬라이드를 사용합니다.

후드 내에서 이 수정된 유리 정사각형 또는 챔버를 최소 15분 동안 UV 멸균합니다. 다음으로 챔버의 중앙 홈에 250 to 300 µL의 polyol lysine을 피펫팅합니다. 그런 다음 챔버를 실온에서 2시간 동안 배양하며, 배양이 끝나기 약 15분 전에 준비합니다.

2시간 후에 Matrigel 용액을 준비하고, poly-L-lysine을 흡입하여 제거한 뒤 중앙 트로프(trough)를 1 mL의 멸균수로 세척합니다. 그 다음, Matrigel 용액 250~300 µL를 중앙 트로프에 분주하고 챔버를 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 Matrigel 용액을 흡입하여 제거합니다.

그 후 SFM 1~2 mL로 중앙 트로프를 부드럽게 세척합니다. 이제 배양된 세포를 준비하기 위해 E-F-H-S-F-M 또는 F-B-S-S-F-M 100 µL를 중앙 트로프에 피펫팅합니다. 다음으로, 뉴로스피어 함유 배양액 4~5 mL를 새로운 60 mm 페트리 접시에 피펫팅합니다.

그런 다음 페트리 접시를 5배율 대물렌즈가 장착된 세포 계수 현미경의 스테이지 위에 놓습니다. P 10 피펫을 사용하여 5~8개의 전체 신경구(neurosphere)를 각 챔버의 중앙 홈으로 조심스럽게 옮깁니다. 최대 4개까지 옮깁니다.

뉴로스피어(Neurospheres)를 한 번에 옮길 수 있으나, 중앙 트로프(troughs)에 있는 뉴로스피어와 섞이지 않도록 주의하십시오. 마트리젤(matrigel) 기질을 손상시키지 않도록 조심스럽게 주변으로 펼쳐줍니다. 그 다음 중앙 트로프에 E-F-H-S-F-M 또는 F-B-S-S-F-M 150 µL를 추가로 첨가합니다.

이제 습윤 배양기에서 세포를 배양합니다. 배양 후 17~20시간이 지나면 미분화 NPCs를 사용할 수 있으며, 배양 후 69~72시간이 지나면 분화된 NPCs를 사용할 수 있습니다.

현미경으로 관찰하며 라이브 셀 이미징 이동 분석에 가장 적합한 세포가 있는 챔버를 선택하십시오. 세포는 거의 완전히 신경구(neurosphere)에서 분리되어 둥근 형태여야 하며, 후드 내에서 돌기 형성을 아직 시작하지 않았거나 막 시작한 상태여야 합니다. 챔버 커버를 준비하십시오.

정사각형 유리 커버슬립을 70% ethanol로 세척한 후, 오토클레이브 멸균수로 세척하고 두 평행한 가장자리에 진공 그리스를 바릅니다. 이제 챔버를 덮습니다. 먼저 중앙 트로프에서 배양액을 흡입하여 제거한 다음, 커버슬립을 직사각형 벽 위에 지붕처럼 빠르게 덮어 밀봉합니다.

다음으로, 모세관 현상을 이용하여 신선한 배지 100 µL를 중앙 트로프(trough)에 주입합니다. 이제 진공 그리스를 사용하여 배지 풀의 경계를 만듭니다. 라이브 셀 이미징 시스템의 중앙 트로프 양 끝단에 준비된 아가로스 겔 튜브, 은-염화은 전극, 그리고 두 개의 60 mm 페트리 접시를 준비합니다.

배양액 저장소로서, 챔버를 37 °C, 5% CO₂ 환경에서 20~30분 동안 안정시킵니다. 이 시간 동안, Dremel이나 툴 피펫을 사용하여 빈 페트리 접시 2개의 뚜껑과 Galvan Axxis 챔버 페트리 접시의 뚜껑에 구멍을 뚫어 준비하고, 중앙 트로프(trough)의 양옆에 1.5~2 mL의 배양액을 넣고 각각의 빈 페트리 접시에 7~8 mL의 SFM을 추가합니다. 챔버 중앙 트로프의 양쪽에 페트리 접시를 하나씩 배치하고, 각 접시에 전극을 하나씩 넣습니다.

챔버와 페트리 접시 사이의 간극을 메워 전기적 연속성을 확보하십시오. Agros 겔 브리지를 사용하여 전극을 외부 전원 공급 장치에 연결하고, 전류 측정을 위해 전압계(M meter)를 직렬로 연결한 후 전원을 켜십시오. 전압계를 사용하여 중앙 홈(central trough)을 가로지르는 전기장의 세기를 직접 측정하십시오.

필요에 따라 전원 공급 장치의 출력을 조절하십시오. 이제 이미징 시스템의 타임랩스 모듈을 시작하십시오. Axio vision 소프트웨어에서 multidimensional acquisition을 선택하고 see를 클릭하십시오.

채널의 경우 6번 채널을 선택하고, 타임랩스를 위해 T를 클릭하십시오. 타임랩스 간격 설정을 1분으로 설정하고, 지속 시간을 8시간으로 설정한 후, 'before' 및 'after time point' 필드에서 이전 및 이후 시점을 선택하십시오. 이제 시작을 클릭하여 원하는 시간 동안 실험을 진행하고, 분석이 완료되면 IHC 분석을 수행하십시오.

운동학적 분석 결과, 250 millivolt per millimeter DCEF 존재 하에서 미분화된 NPC는 해당 전계 강도에서 음극을 향해 매우 정방향적이고 빠른 갈바노택시스(galvanotaxis)를 보이는 것으로 나타났으며, 이미징이 수행된 6~8시간 전체 동안 미분화된 NPC의 98% 이상이 이동하였습니다. A-D-C-E-F가 없는 경우에는 세포의 무작위적인 움직임이 관찰되었습니다.

죽은 세포는 이동하지 않으므로, 이는 이 기간 동안 세포들이 생존해 있음을 시사합니다. A-D-C-E-F의 존재 여부와 관계없이, 분화된 표현형은 분화된 세포의 A-D-C-E-F 하위 집합이 있는 경우와 없는 경우 모두에서 이동이 거의 일어나지 않았습니다. DCEF 방향에 수직으로 정렬되는 경향을 보이는 신장된 돌기들은 관찰되었으나, 세포체 자체의 뚜렷한 전위는 관찰되지 않았습니다.

면역염색을 통해 NPC가 6시간의 DC EF 노출 후에도 신경 전구세포 마커인 nestin의 양성 발현을 유지함을 확인하였습니다. NPC를 성숙한 표현형으로 분화하도록 유도한 분석에서는, 대부분의 세포가 6시간의 DCEF 노출 후 성숙한 성상교세포 마커인 glial fibrillary acidic protein 또는 GFAP을 발현합니다. 이 절차를 통해 유전자 녹아웃 모델을 사용하여 직류 전기장이 세포 운동성으로 변환되는 과정에 관여하는 세포 메커니즘에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다.

또는 예를 들어, 선생님.