아밀로이드 전구체 단백질 세포 내 도메인의 정화 및 집계

이 절차의 목적은 A ICD로 알려진 아밀로이드 전구체 단백질 세포 내 도메인을 정제하고, 원자 힘 현미경을 이용한 A ICD의 열 응집 및 특성 분석 프로토콜을 제시하는 것입니다. 이는 먼저 박테리아에서 A ICD의 A GST 융합 단백질을 발현시킴으로써 수행됩니다. 다음으로 G-S-T-A-I-C-D 단백질을 정제한 후 트롬빈으로 절단하여 GST를 A ICD로부터 분리하고 GST를 제거합니다.

그 후 A ICD의 열 응집을 유도합니다. 마지막으로, 원자 힘 현미경을 사용하여 A ICD 응집체를 이미지화합니다. 최종적으로, 생화학 및 생물물리학적 분석에 충분한 양의 A ICD를 균질하게 정제할 수 있음을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

복잡한 크로마토그래피 단계가 필요한 기존 방법들에 비해 이 기술의 주요 장점은 고순도의 가용성 ICD를 표준 시약과 장비를 사용하여 벤치탑에서 분리할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜로 생산된 ICD는 추가적인 생화학적 및 생물물리학적 특성 분석에 적합합니다.

시연은 Amina ti가 진행하겠습니다. 본 연구실의 이전 박사후 연구원인 Dr.Andres Oberer가 A ICD의 원자 힘 현미경(atomic force microscopy) 이미징 수행 방법을 시연할 것입니다. 재조합 A PP 세포내 도메인 또는 A ICD를 발현시키기 위해, GST의 C-말단에 인간 A ICD가 융합된 pgx 41 벡터로 형질전환된 BL 21 세포로 시작하십시오. 단일 콜로니를 사용하여 ampicillin이 포함된 LB 배지 10 milliliters에 접종한 후, 37 °C에서 격렬하게 흔들어주며 하룻밤 동안 배양하십시오.

1리터 플라스크에 400 milliliters의 LB ampicillin과 5 milliliters의 하룻밤 배양액을 넣고 배양합니다. 600 nanometers에서의 흡광도가 0.4에서 0.6에 도달할 때까지 37 degrees Celsius에서 강하게 흔들어 배양합니다. G-S-T-A-I-C-D의 발현을 유도하는 데 보통 2에서 2.5시간이 소요됩니다.

0.4 mM의 IPTG를 첨가하고 37 °C에서 강하게 흔들어주며 5시간 동안 배양합니다. 4 °C에서 6,000 ×g로 15분 동안 세포를 원심분리하고 펠렛을 -80 °C에 보관합니다. 용해 버퍼를 준비하여 얼음에 둔 후, 펠렛에 20 mL의 버퍼를 첨가하고 파이펫을 사용하여 얼음 위에서 볼텍싱과 교반을 병행하여 충분히 혼합합니다.

재현탁된 세균 펠릿을 미리 냉각된 유화기 또는 프렌치 프레스(French press)에 통과시킵니다. 30,000 PSI에서 용해물을 유화기에 다시 한 번 통과시키고, 미리 냉각된 50 milliliter 튜브에 용해물을 수집합니다. 용해물을 15,000 ×g, 4 °C에서 30분 동안 원심분리합니다.

상층액을 분리하여 미리 냉각시킨 50 milliliter 튜브로 옮깁니다. 50% glutathione agarose 슬러리 500 microliters를 첨가합니다. 샘플을 회전시키면서 4 °C에서 30분 동안 회전 혼합합니다.

배양 후에 신선한 용출 버퍼를 제조합니다. 용해물과 슬러리를 거친 필터가 장착된 5인치 일회용 폴리스티렌 크로마토그래피 컬럼에 붓습니다. 3mL의 PBS로 컬럼을 5회 세척합니다.

컬럼 하단을 캡으로 닫고 상온의 용출 버퍼 500 µL를 추가합니다. 컬럼 상단을 캡으로 닫고 상온에서 5분 동안 회전시킵니다. 초기 용출액을 냉각된 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 수집합니다.

용출 과정을 두 번 더 반복합니다. 용출액을 10,000 분자량 컷오프 투석막에 넣고 4 °C의 PBS 4L에서 하룻밤 동안 투석한 후, 다음 날 4 °C의 PBS 4L로 1시간 동안 추가 투석합니다.

투석 카세트에서 단백질을 꺼내고 단백질 정량 분석을 수행하여 G-S-T-A-I-C-D의 수율을 결정합니다. 400 milliliters의 배양액을 이용한 전형적인 정제 과정에서는 20 milligrams 이상의 정제 단백질 수율과 10 to 20 milligrams per milliliter의 농도를 얻게 됩니다. 단백질을 200 microliter씩 분주하여 -80 °C에서 냉동 보관하십시오.

GST 융합체로부터 A ICD를 분리하기 위해, 정제된 G-S-T-A-I-C-D 200 µL에 1 U/µL 농도의 thrombin 20 µL를 첨가하고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 4 °C에서 20,000 ×g로 30분간 원심분리하여 응집된 물질을 제거합니다. GST와 thrombin을 제거하기 위해 상층액을 미리 냉각시킨 마이크로 튜브로 옮깁니다. 여기에 50% glutathione aro slurry 50 µL와 50% p and wino zaine aro slurry 50 µL를 각각 첨가합니다.

실온에서 5분 동안 회전시키며 배양합니다. 짧게 원심분리하여 agro beads를 침전시키고, 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 글루타치온을 사용하여 GST를 4회 더 추출합니다.

정제된 A ICD 5 µL에 대해 단백질 정량 분석을 수행합니다. 400 mL 배양액에서의 일반적인 수율은 0.2~0.5 mg/mL 농도에서 50~100 µg입니다. 갓 준비한 A ICD를 PBS로 희석하여 0.1 mg/mL 농도로 만든 후, 가열 쉐이커에서 43 °C, 800 RPM으로 48시간 동안 샘플을 배양하여 열 응집을 유도했습니다.

탈이온수로 샘플을 20배 희석한 후, 새로 절단된 Mica 위에 2 µL를 점적합니다. 응집된 Aβ ICD를 시각화하기 위해 데시케이터에서 샘플을 하룻밤 동안 건조시킵니다. 공칭 팁 반경이 2 nm인 금 코팅 질화규소 캔틸레버를 사용하여 태핑 모드의 원자힘 현미경으로 관찰합니다.

이미징 중 일반적인 태핑 진폭은 캔틸레버의 공진 주파수에서 10 to 20 nanometers입니다. G-S-T-A-I-C-D의 발현 및 상대적 농축도가 여기에 표시되어 있습니다. 용해 후 융합 단백질의 대부분이 수용성 분획에 존재하므로, 봉입체로부터의 추출은 필요하지 않습니다.

글루타치온 어피니티 컬럼에서 용출된 물질의 순도는 95% 이상이었습니다. 본 실험에 사용된 준비물에서 컬럼으로부터 용출된 단백질의 농도는 14.5 mg/mL였으며, 수득량은 22 mg이었습니다. 이 준비물 200 µL를 20 units의 thrombin으로 하룻밤 동안 처리한 결과, 융합 단백질의 거의 100%가 절단되었습니다.

사용된 thrombin의 양은 kumasi로 검출되지 않을 정도로 적습니다. Blue 염색과 thrombin 및 GST 제거 과정에서 일부 물질 손실이 발생했습니다. 그럼에도 불구하고 순도는 90% 이상이었으며, 이번 조제에서 0.35 mg/mL 농도로 70 µg의 A ICD를 얻었습니다.

FM으로 촬영한 EICD 응집체는 일반적으로 스테로이드 무정형이며 크기는 50에서 100 nm 범위입니다. 샤페론인 UBI Quillin 1을 등몰량으로 응집 반응에 첨가하면 응집된 물질이 검출되지 않습니다. 이 영상을 시청한 후에는 EICD를 정제하고 응집을 유도하며, AFM으로 EICD 응집체를 촬영하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

이 기술로 정제된 시료는 광산란 및 필터 트랩 분석과 같은 다른 방법에 적용하여, 분자 샤페론이 EACD 응집에 미치는 영향에 관한 의문점을 해결하는 데 활용될 수 있습니다.