종양의 4D 라이브 세포 이미징을위한 MAME 모델 : Microenvironment 상호 작용 영향을 미치는 악성 진행

이 실험 절차의 전반적인 목표는 실시간 세포 간 상호작용의 라이브 세포 이미징에 사용할 수 있도록 유방 구조 및 미세환경 공학(mammary architecture and microenvironment engineering, MAM)이라 명명된 3D 공동 배양 모델을 구축하는 것입니다. 이는 먼저 커버슬립을 fibroblast D quenched, 또는 DQ collagen one 콜라겐 1 매트릭스로 코팅함으로써 달성됩니다.

다음으로 DQ 퀀칭 콜라겐(quenched collagen)을 준비합니다. 응고된 DQ 콜라겐 I 매트릭스 위에 재구성된 기저막 매트릭스(bassent membrane matrix)를 추가하여, 섬유아세포가 내포된 콜라겐 I 매트릭스를 형성합니다. 세 번째 단계에서는 상피 세포 또는 종양 세포 현탁액을 커버슬립 위에 층을 이루도록 도포하여 세포가 DQ 콜라겐 IV 재구성 기저막 매트릭스에 부착되도록 한 후, 배지를 추가합니다.

마지막으로, 공초점 현미경을 사용하여 살아있는 mam 공동 배양의 3차원 공간 및 시간 차원을 분석하는 4D 이미징을 수행합니다. 궁극적으로 4D 이미징을 통해 유방암 세포와 종양 미세환경의 다른 세포들 사이의 역동적인 상호작용을 시각화하고 분석할 수 있으며, 이는 침습적 표현형으로의 진행에 영향을 미칠 수 있습니다. 생체 내 이미징(intra vital imaging)과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 관찰되는 상호작용이 예를 들어 인간 종양 세포와 마우스 기질 세포 사이가 아니라, 인간 종양 세포와 인간 종양 관련 세포라는 단일 종의 세포들 사이에서 일어난다는 점입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 메인 코어 배양물을 조립하는 과정을 먼저 시각적으로 이해해야 하며, 성공을 위해서는 어느 정도의 기술과 연습이 필요하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 먼저 알코올로 멸균한 직사각형 플라스틱 커버 한 개를 배치하십시오. 이를 35 mm 배양 접시에 넣거나 IBI tree 35 mm mu 접시를 사용하십시오.

그런 다음 원하는 수의 섬유아세포를 DQ 콜라겐과 혼합합니다. 다음으로, 100 µL 마이크로 피펫을 사용하여 70 µL의 섬유아세포 DQ 콜라겐(1-collagen 1-matrix)을 커버슬립 전체 표면에 조심스럽게 피펫팅하여 도포하고, 배양 접시를 이산화탄소가 없는 37 °C 습윤 배양기에 30분 동안 둡니다. 매트릭스가 응고된 후, 5% 이산화탄소가 포함된 37 °C 배양기에서 10분 동안 평형을 유지하도록 합니다.

그런 다음 디쉬를 후드 아래에 두고 실온이 될 때까지 둡니다. 응고된 DQ 콜라겐 위에 DQ collagen, four reconstituted basement membrane matrix 60 µL를 첨가하고, 섬유아세포가 내장된 collagen one matrix를 올립니다. 그런 다음 피펫 팁을 사용하여 섬유아세포가 포함된 DQ collagen one, collagen one matrix에 긁힘이 생기지 않도록 주의하며 DQ collagen four reconstituted basement membrane matrix를 고르게 펴줍니다.

그 다음, DQ collagen IV reconstituted basement membrane matrix가 응고되는 동안 디쉬와 커버슬립을 5% carbon dioxide 농도의 37 °C 인큐베이터에 10분간 옮겨 둡니다. 그 사이 trypsin을 처리한 세포를 분리하여 공동 배양을 위한 세포 수를 측정합니다. 이제 세포 현탁액 50 µL를 코팅된 커버슬립 위에 분주하고, 세포가 DQ collagen IV reconstituted basement membrane matrix에 부착될 수 있도록 디쉬를 5% carbon dioxide 농도의 37 °C 인큐베이터에 40~60분간 넣어 둡니다. 세포가 매트릭스에 부착된 후, 2% reconstituted basement membrane이 포함된 배양액 2 mL를 35 mm 디쉬에 첨가합니다.

그런 다음 PBS로 세척한 후, 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 5 µM의 Cell Tracker Orange가 포함된 MEGM 배지로 공배양물을 45분 동안 배양합니다. 배양 후 공배양물을 PBS로 다시 세척하고, 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 미리 데워둔 MEGM 배지와 함께 30분 동안 배양합니다. 공배양물을 저배율(예를 들어, 공초점 현미경의 water dipping 렌즈를 사용하여 10x)로 이미징합니다. 구조물의 전체 깊이에 걸쳐 10 µm 간격으로 광학 절편을 캡처합니다.

velocity 소프트웨어 또는 유사한 프로그램을 사용하여 광학 섹션을 통해 이미지를 3D로 재구성하십시오. 구조, 세포 간 상호작용 및 주변 기질과의 상호작용을 시각화할 수 있도록 3D 재구성 영상을 제작하십시오. 이 대표적인 공동 배양 도식도에서, IBI 처리된 mu dish는 먼저 콜라겐으로 코팅되었으며, 하나는 DQ 콜라겐을 포함하고, 다른 하나는 여기에서 마젠타색으로 표시된 섬유아세포를 포함하고 있습니다.

그 다음 DQ collagen four가 포함된 재구성된 기저막의 두 번째 층을 추가했습니다. 다음으로 빨간색으로 표시된 종양 세포를 그 위에 2% 재구성된 기저막 배양액과 함께 파종했습니다.

크림색 점으로 표시된 배지는 매 배지 교체 시마다 겹쳐서 추가되었습니다. DQ collagen one 및 four의 형광 분해 산물은 녹색으로 표시되었습니다. 이 대표적인 MCF 10 DCIS와 WS 12 TI 공배양의 23일 동안, 여기와 다음 그림들에서 빨간색으로 나타난 세포들의 증식과 여기서 및 다음 그림들에서 녹색으로 관찰된 DQ collagen four 및 one의 분해가 있었으며, 공배양의 부피 감소를 통해 콜라겐 매트릭스의 분해가 확인되었습니다.

동일한 생세포 공동 배양물을 23일 동안 관찰하였으며, 공동 배양 3일, 16일, 23일째에 공초점 현미경으로 이미지를 캡처하였습니다. Mame 공동 배양물의 상호작용은 역동적이며 시간에 따라 변화할 수 있습니다. 예를 들어, 배양 3일째의 세포 mam 공동 배양 3D 모델에서 볼 수 있듯이, 이 시점에서 세포들은 매트릭스 내에서 막 증식하기 시작했으며, 녹색 형광이 나타나지 않는 것으로 보아 여전히 매우 안정적인 상태입니다.

하지만 16일째가 되면, 세포가 계속 증식함에 따라 여기서 초록색으로 관찰되는 DQ collagen 1 및 4 절단 생성물과, 매트릭스와 세포가 함께 형광을 발하여 노란색으로 관찰되는 세포에 의한 매트릭스의 활발한 분해가 시작됩니다. 공배양 부피가 110,000 cubic micrometers였던 3일째와 비교했을 때, 23일째에는 급격히 증식하는 세포들에 의해 매트릭스의 거의 절반이 분해되었습니다. 16일에서 23일 사이에 부피는 이 날 기준으로 46,250 cubic micrometers까지 감소했습니다.

16 공배양에서, 빨간색으로 표시된 DCIS 세포 표면의 DQ collagen four 단백질 분해와 흰색으로 표시된 섬유아세포 인근 영역의 DQ collagen one의 확산성 단백질 분해를 관찰할 수 있습니다. 이 공배양에 사용된 차별적 염색법을 통해 두 세포 유형의 발달 후 뚜렷한 이동 및 증식 패턴을 관찰할 수 있습니다. 이 기술은 유방암 분야의 연구자들이 암세포와 주변 기질 세포 간의 역동적인 상호작용에 대한 살아있는 세포 이미징을 통해 종양 거시환경이 암 진행에 미치는 영향을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.