인플루엔자 중합 효소의 유전자에 대한 구조 결정 PB2 소단위를위한 멀티 타겟 병렬 처리 방식

다음 실험의 전반적인 목표는 여기서 제시된 사례와 같이 단일 유전자 또는 유전자 서열만으로 시작하여, X선 결정학을 통해 표적 단백질의 구조를 체계적으로 결정하기 위한 다중 표적 접근법을 사용하는 것입니다. 표적 단백질은 바이러스 복제의 핵심 구성 요소인 인플루엔자 A의 PB2 중합효소 서브유닛입니다. 다중 표적 접근법은 단일 표적 서열과 단백질에 대해 알려진 기타 정보를 바탕으로 일련의 유전자 구조물을 병렬적으로 설계하고 클로닝함으로써 달성됩니다.

두 번째 단계는 각 컨스트럭트의 발현 수준을 테스트하고, 세포 배양을 통한 대규모 단백질 발현에 가장 적합한 것을 선택하는 것입니다. 다음 단계에서는 세포를 파쇄하여 발현 물질로부터 표적 단백질을 분리하고, 이를 매우 높은 순도로 정제해야 합니다. 그 후, 각 단백질을 사용하여 X선 연구에 적합한 결정 형태를 얻기 위해 일련의 결정화 실험을 수행합니다.

그 다음, 하나 이상의 결정에서 고해상도 X선 회절 데이터를 수집하고 이를 사용하여 각 표적 단백질의 구조를 나타내는 전자 밀도 지도를 풀고 정밀화합니다. 이러한 결과는 전자 밀도 지도를 기반으로 표적 단백질의 3차원 구조를 렌더링할 수 있게 합니다. 다중 표적 처리는 경로상의 모든 잠재적 장애물에서 실행 가능한 대안을 제공함으로써 구조 결정의 성공 가능성을 크게 높여줍니다.

여러 표적을 병렬로 처리하는 방식 또한 매우 효율적이며, 각 단계에서 단백질당 소요되는 시간과 비용을 줄여줍니다. 약물 표적에 대한 구조 결정 속도를 높임으로써 연간 더 많은 치료제 개발 기회를 확보할 수 있을 것입니다. 이 방법은 구조 생물학에서 귀중한 통찰력을 제공할 뿐만 아니라, 이를 통해 얻은 고순도 단백질은 모든 단백질 기반 연구를 지원할 수 있습니다.

공정의 각 단계는 고유한 과학적 원리를 기반으로 하며 그에 따른 전문 지식을 필요로 하지만, 인력, 기기 및 노하우에 대한 투자는 모든 요소가 결합되었을 때 매우 훌륭한 성과를 낼 수 있습니다. 연구 대상 유전자와 유전자 산물이 선정되면, 첫 번째 단계로 여러 가지 유전적 변이체 또는 구성물을 설계해야 합니다. 유전자 설계 소프트웨어를 사용하여 단백질 수준에서 이러한 구성물을 설계하고, 설계된 합성 유전자 서열에 연관된 코드를 함께 작성합니다.

정렬 뷰어(alignment viewer) 모듈과 구조 설계(construct design) 모듈을 사용하여 단백질 서열 정렬을 비교하고, 단백질 구조 설계를 위한 삽입 PCR 및 벡터 PCR 종단 프라이머 또는 앰프(ampers)를 정의하십시오. 다음으로, 유전자 합성기(gene composer)의 단백질-DNA 알고리즘을 사용하여 각 아미노산 서열을 설계된 핵산 서열 코드로 역번역하십시오. 적절한 코돈 사용 표를 사용하여 특정 세포주에서 발현되도록 서열을 최적화하십시오.

이 사례에서는 e coli 박테리아를 사용합니다. 표적 유전자 서열이 준비되면, 가상 클로닝을 통해 박테리아 발현에 적합한 벡터 플라스미드에 유전자를 삽입합니다. 여기서는 변형된 PET 28 벡터를 사용합니다.

이 벡터는 발현 및 단백질 정제에 필요한 특정 성분들을 포함하고 있습니다. 표적 유전자는 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 히스티딘 태그 서열과 정제 과정 중 태그 제거를 가능하게 하는 절단 서열이 삽입되도록 수정되었습니다. 또한, 이 벡터는 발현 테스트 및 배양을 위한 항생제 내성 유전자를 보유하고 있습니다.

그 후, 각 표적 단백질의 유전자 서열을 표준 유전자 합성 방법을 통해 생성하여 pipe cloning polymerase incomplete primary extension cloning(pipe cloning)을 준비합니다. pipe cloning은 표적 유전자를 의도한 벡터와 상보적인 프라이머로 증폭시키는 PCR 기반의 클로닝 전략입니다. 이 방법은 PCR 후기 단계의 불완전한 특성을 이용하여 PCR 생성물의 말단에 가변적인 단일 가닥 서열이 남게 합니다. 각 반응액에 정방향 및 역방향 프라이머를 각각 5 µL씩 첨가하여 insert PCR(IPCR)을 준비합니다.

플레이트 맵에 따라 96-웰 플레이트의 각 해당 웰에 2 µL의 전장 합성 유전자를 각각 첨가합니다. 각 웰에 25 µL의 PFU 마스터 믹스를 첨가한 후, 다음 PCR 조건으로 반응을 25회 반복합니다. 95 °C에서 30초 동안 변성시킵니다.

50 °C에서 45초 동안 어닐링하고 68 °C에서 3분 동안 연장합니다. 단편 증폭은 IPCR 산물의 AGROS 겔 분석을 통해 확인합니다. 성공적인 IPCR 산물은 뚜렷한 밴드로 나타납니다.

바람직하지 않은 결과는 종종 별도의 반응에서 희미하거나 끌림(smear)이 있는 밴드로 나타납니다. 발현 플라스미드는 벡터 PCR(VPCR)로 증폭하거나, VPCR 산물의 AROS 겔 분석을 통해 VPCR 단편 증폭을 확인합니다. IPCR 및 VPCR 산물이 증폭되면, 이를 머지 플레이트(merge plate)에 추가하고 머지 반응을 위해 서모사이클러(thermocycler)에 넣습니다.

성공적으로 클로닝된 컨스트럭트를 화학적 컴피턴스 e coli 세포에 형질전환시키고, 발현 테스트 스트리킹을 시작하기 위해 글리세롤 스톡에 보관합니다. 각 글리세롤 스톡 샘플의 소량을 별도의 아가 플레이트에 스트리킹합니다. 이 플레이트는 박테리아 영양 배지와 벡터에 인코딩된 항생제 마커 Kanamycin으로 제작되었으며, 다음 날까지 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

새로 배양한 agar 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하여 각 샘플의 전배양을 시작합니다. 병렬 처리를 위해 이 콜로니를 kanamycin과 glucose가 첨가된 1.2 milliliters의 TB broth에 접종합니다. 각 전배양은 96 well round bottom block에서 수행합니다.

37 °C에서 분당 220회 회전 속도로 진탕 배양하며 하룻밤 동안 키웁니다. 하룻밤 배양 후, 각 샘플당 40 µL의 전배양액을 접종하여 소규모 유도 배양을 시작합니다.

1.2 mL의 TB broth. 50 mg/mL의 kanamycin과 Novagen overnight express system을 첨가하였다. 1, 유도 배양물을 20 °C에서 220 RPM으로 흔들어주며 48시간 동안 배양한다. 4,000 GForce로 15분간 원심분리하여 세포를 수확한다.

상청액을 따라내고, 정제 후 추가 공정을 진행하기 전 최소 1시간 동안 펠릿을 -20°C에서 보관하십시오. 제조사의 프로토콜에 따라 caliper lab CHIP 90 시스템을 이용한 모세관 전기영동법으로 절단 반응 유무에 따른 단백질을 분석하십시오. influenza A PB2 단백질의 경우, 34개의 구축물 중 14개가 가용성 표적 단백질을 형성하여 다음 단계인 대규모 발효 공정으로 진입하였습니다.

대규모 배양을 시작하기 위해, glycerol stock으로부터 50 mg/mL의 Can mycin이 포함된 박테리아 세포 배양액 100 mL에 접종하고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이때 220 RPM으로 진탕 배양합니다. 다음 날, 10 mL를 사용하여 전배양액을 확장 접종합니다.

2L 배플 플라스크에 자동 유도 배지와 50 mg/mL의 kanamycin이 포함된 배양액 1L를 넣습니다. 확장 배양된 배양액을 37 °C에서 약 30분 간격으로 흔들어 줍니다. 600 nm 파장에서의 UV 흡광도를 측정하여 배양액의 광학 밀도를 확인합니다.

광학 밀도가 0.6에 도달하면, 원하는 배양 시간이 지난 후 진탕 배양기의 온도를 20 °C로 변경합니다. 발현 테스트를 위해 각 컨스트럭트에서 대표로 10 mL의 aliquot을 취합니다. 5,000 ×g에서 15분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다.

상청액을 따라내고 세포 펠렛을 -80°C에서 냉동합니다. 이 절차를 시작하려면, 세포 페이스트를 1:5의 마스터 볼륨 비율로 용해 버퍼에 해동 및 재현탁합니다. 4°C에서 30분 동안 격렬하게 교반합니다.

깨끗한 스파튤라를 사용하여 비커 벽면에 붙은 덩어리를 떼어냅니다. 초음파 분쇄기를 사용하여 얼음 위에서 세포를 기계적으로 용해합니다. 4°C에서 18,000 GForce units로 30분 동안 원심분리하여 조추출물을 투명하게 정제합니다.

대규모 정제를 진행하기 전 상층액을 수집하고 분석을 위해 소량의 분취액을 보관하십시오. SDS page 겔 분석을 통해 각 배양액의 대규모 단백질 발현을 확인하십시오. 이 대표 SDS page 결과는 강력한 단백질 발현과 약 50%의 용해도 및 약 50%의 절단 효율을 보여줍니다.

본 사례에서는 히스티딘 태그와 함께, 원래의 컨스트럭트에 설계되어 추가되었던 단백질 용해성 태그를 제거하였습니다. 니켈 레진은 고유한 히스타민 태그가 부착된 표적 단백질을 천연 박테리아 단백질을 포함한 모든 다른 세포 물질로부터 분리하는 데 사용됩니다. 니켈 컬럼 하나를 준비하여 보관 버퍼를 제거하기 위해 4 컬럼 부피의 초순수로 세척한 후, 1 컬럼 부피의 버퍼 B와 5 컬럼 부피의 버퍼로 순차적으로 세척합니다.

단백질 제조기를 사용하여 A 및 E 평형화 병렬화를 수행하며, 이는 여러 컬럼을 동시에 가동할 수 있습니다. 가용화된 히스티딘 태그 단백질이 포함된 각 정제된 용해물을 분당 2 mL의 속도로 각각의 컬럼에 로딩한 후, 버퍼 A로 컬럼 부피의 수 배만큼 세척하고, 통과액 버퍼를 수집하여 분석을 위해 보관합니다. 결합된 단백질을 버퍼 A와 B의 비율이 95:5, 60:40, 그리고 최종적으로 100% 버퍼 B인 일련의 단계적 구배(step gradient)로 용출합니다. 버퍼 B의 성분들이 니켈 레진에 대해 히스티딘과 경쟁하므로, 정해진 비율에 따라 단백질을 컬럼에서 제거하게 됩니다.

각 용출 분획을 별도로 수집합니다. 니켈 컬럼에서 수행한 대표적인 크로마토그램 결과가 여기에 제시되어 있습니다. SDS page를 통해 니켈 컬럼 용출 분획, 조용해물(crude lysate), 정제 용해물(clarified lysate) 및 니켈 컬럼 통과액(flow through)을 분석하고, 이를 컬럼 정제 중에 측정된 280 nm에서의 UV 흡광도와 비교하십시오.

이 단계에서는 정제가 성공적으로 이루어졌는지 확인합니다. 표적 단백질이 포함된 분획을 선택하고 모아 다음 처리 단계로 진행합니다. 모은 분획의 총 부피를 고려하고 280 nm에서 UV 흡광도를 측정하여, 해당 단백질의 이론적 소쇠 계수를 이용해 이 단계에서의 총 단백질 양을 계산합니다.

분석을 위해 소량의 샘플을 따로 보관하십시오. 표적 단백질의 유전자는 ULP1이 절단 부위로 인식하는 특정 서열로 인코딩되었으므로, ULP1을 첨가하면 히스티딘 태그와 목적 단백질 사이가 절단됩니다. 이 절차를 시작하려면, 통합 분획액에 포함된 단백질 5 mg당 1 µL의 ubiquitin like protease, one을 첨가하십시오.

이 단계에서 절단된 단백질을 투석 튜브를 사용하여 버퍼 B에서 버퍼 A로 옮겨 추가 처리를 진행하며, 교반하며 4°C에서 4시간 동안 2L의 버퍼 A로 단백질을 투석합니다. 투석 후 PB2에 대해 10 kilodalton 분자량 컷오프를 사용하십시오. ULP1의 존재 여부에 따라 표적 단백질의 SDS-PAGE 젤을 다시 실행합니다.

이를 통해 ULP1 절단이 성공적으로 이루어졌는지 확인하고, 이후 공정에 사용할 최적의 분획을 선택할 수 있습니다. 여기에 중합효소 pb의 세 가지 구축물에 대한 대표적인 SDS page 결과가 제시되어 있습니다. 레인 1에는 두 종류의 서브유닛 분자량 마커가 있습니다.

2, 6, 10번 레인은 니켈 1번 컬럼에서 풀링된 단백질입니다. 3, 7, 11번 레인은 니켈 2번 컬럼에서 버퍼 A를 사용하여 절단된 단백질의 플로우스루(flow through)를 포함하며, 4, 8, 12번 레인은 니켈 2번 컬럼에서 버퍼 B를 이용해 히스티딘 태그가 제거되었음을 보여줍니다.

히스타민을 제거한 후, nickel two에서 얻은 통합 분획물을 농축합니다. SEC를 시작하려면 표적 단백질의 분자량에 따라 적절한 레진을 다시 선택해야 합니다. 이 경우, acere S 110 over 30 GL 컬럼을 사용하며, 5 mL 주사기를 이용하여 0.5 mL/min의 유속으로 200 mL의 SEC 버퍼로 평형화합니다. 샘플을 10 mL 샘플 루프에 로딩하고 SEC 컬럼 런을 시작합니다. 소량의 분획물을 수집하면서 280 nm에서 UV 흡광 크로마토그램을 모니터링합니다.

모든 관련 SEC 분획물을 SDS page로 분석합니다. 단백질 결정화 시험의 표준 접근법은 증기 확산법을 이용한 sitting drop 방식으로 수행됩니다. 각 표적 단백질에 대해 초기 단계에서 두 개 이상의 sparse matrix 스크리닝을 설정하는 것이 일반적입니다.

이 과정을 시작하려면 96-웰 컴팩트 주니어 결정화 플레이트의 각 리저버에 선택한 결정화 스크리닝의 각 조건별로 80 µL씩 미리 채웁니다. SEC 버퍼에 희석된 단백질 0.4 µL를 96개 웰 각각에 분주합니다. 그다음 결정화 스크리닝 용액 0.4 µL를 추가하여 각 웰의 드롭이 완전히 혼합되도록 합니다. 전체 플레이트를 크리스탈 클리어 실링 테이프로 덮어 모든 웰이 완전히 밀봉되었는지 확인합니다. 플레이트는 환경 진동이 없는 안정적인 장소의 16 °C에 보관합니다.

향후 몇 주 동안 해부 현미경으로 단백질 결정화 여부를 주기적으로 확인하십시오. 단백질 결정이 나타나지 않으면, 수확 전 성공 확률을 높이기 위해 최종 드롭의 단백질 농도를 변경하고 다른 조건으로 새로운 플레이트를 설정하십시오. 수확을 시작하려면 액체 질소가 채워진 듀어(dewar) 내에서 ALS 스타일 퍽(puck)을 냉각하고 뚜껑으로 덮으십시오.

표적 단백질 결정이 들어있는 웰을 덮고 있는 투명 테이프를 잘라 근처의 빈 웰로 옮깁니다. 해당 결정화 조건 용액 1.6 µL를 취해 에틸렌 글리콜 0.4 µL와 혼합합니다. 결정화 조건에 20% 에틸렌 글리콜이 포함된 용액은 단백질 결정을 보호하는 역할을 합니다.

급속 냉각(cryo freezing) 과정 중에 현미경으로 결정을 분석하고, 루프의 내경이 결정의 최대 너비와 일치하도록 적절한 크라이오 루프(cryo loop)를 선택하여 수확하십시오. 크라이오 루프를 자성 결정 완드(magnetic crystal wand)에 부착하고, 웰 용액에서 결정을 직접 루프로 낚아 올립니다. 수확한 결정이 담긴 크라이오 루프를 즉시 동결 보호제(cryoprotectant)에 담근 후, LS 스타일 퍽(LS style puck)에 침전시키십시오.

원하는 수의 결정이 얻어질 때까지 결정을 급속 동결하십시오. 수집이 완료되면, 퍽 완드를 사용하여 급속 동결된 결정이 담긴 퍽의 굽은 텅(tongue) 부위에 자석 덮개를 덮으십시오. 다음 단계를 위해 퍽을 뒤집으십시오.

퍽 푸셔를 퍽에 나사로 고정한 다음, 퍽을 KU actor doer로 옮겨 덮개를 제거합니다. 퍽 안의 결정은 J Director 이미지 획득 소프트웨어를 이용한 X선 회절 분석 준비가 될 때까지 액체 질소조에서 냉동 상태로 유지합니다. 결정 스크리닝을 위해 빔 슬릿 0.5 degree, 검출기 거리 50 millimeters, 이미지 스텝 70 degree, 노출 시간 30 seconds로 파라미터를 설정하십시오.

결정을 스크리닝하는 동안 이미지 획득 소프트웨어에서 캡처한 예시 스크린샷입니다. 중앙 패널은 대표 결정에서 관찰된 x-선 회절 패턴을 보여주며, 3차원 구조 결정에 필요한 완전한 데이터 세트를 얻기 위해 고해상도 이미지를 충분히 수집하였습니다. 본 영상에서 시연한 클로닝 및 단백질 정제 전략을 통해 14개의 정제된 PB two 샘플을 얻었으며, 그중 9개에서 회절 연구에 적합한 결정이 생성되었습니다. 자체 x-선 회절 데이터 세트는 9개의 컨스트럭트 중 5개에 대해 Rigaku Super Bright FRE plus 회전 양극 x-선 발생기를 사용하여 QK alpha 방사선으로 수집하였으며, 이 장비에는 Ossec Variax HF, HF optics 및 Saturn 944 plus CCD 검출기가 장착되어 있습니다.

폴리머라제 PB 두 번째 서브유닛의 X선 회절 이미지가 여기에 제시되어 있습니다. 각 데이터 세트를 처리하여 PB 두 번째 서브유닛의 총 4가지 구조를 결정했습니다. 각 구조는 동료 검토를 거쳐 공공 액세스를 위해 단백질 구조 데이터 은행(Protein Data Bank)에 업로드되었습니다.

이 그림은 결정학적 비대칭 단위 내 분자들의 리본 다이어그램을 보여줍니다. 4개의 PB2 구조 중, 2차 구조는 각각의 PDB 코드와 함께 무지개 패턴으로 색칠되어 있습니다. 이 표에는 본 비디오 논문에서 설명한 방법으로 분석한 인플루엔자 PB2 타겟의 결과 분석 내용이 제시되어 있습니다.

유전자부터 구조 결정까지의 다중 표적 병렬 처리 파이프라인은 클로닝, 용해도 분석, 정제, 결정화, 그리고 구조 결정의 다섯 단계로 설명됩니다. 당사의 구조 생물학 파이프라인 결과물은 구조 기반 연구의 기초를 제공할 뿐만 아니라, 단백질 기능을 확인하기 위한 기능 분석이나, 약물 개발을 위한 새로운 출발점을 찾기 위해 MAR 또는 SPR을 이용한 신규 화합물의 생물물리학적 스크리닝과 같은 추가 연구에 활용됩니다. 이 기술과 함께 개발된 도구들은 구조 기반 약물 설계 등 발견 기반의 다양한 조사들을 수행할 수 있는 길을 열어주었으며, 이는 인류의 건강과 질병 치료에 지대한 영향을 미쳤습니다.

이 영상을 시청하신 후, 다중 타겟 병렬 처리가 구조 결정의 성공률을 어떻게 크게 높일 수 있는지 충분히 이해하시게 될 것입니다. 구조 생물학 실험실에서의 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 실험 활동 중에는 항상 개인 보호구(PPE) 착용과 같은 적절한 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.