형광 현미경을 사용하여 Nematodes에 박테리아를 머릿속으로

본 절차의 전반적인 목표는 선충 숙주 내에서 형광 표지된 박테리아 공생 관계를 관찰하는 것입니다. 이는 먼저 접합을 통해 박테리아를 형광 단백질로 표지함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 알을 수확하여 AIC 선충을 분리하는 것입니다.

다음으로, AIC 선충을 형광 표지된 박테리아 공생균과 함께 배양하여 자연적인 결합을 유도하고, 최종적으로 선충 숙주 내에서 박테리아 공생균의 위치를 파악합니다. 그리고 형광 현미경을 통해 선충 집단 내에서 이러한 결합이 일어나는 빈도를 결정할 수 있습니다. 이 방법은 박테리아가 숙주 내 어디에 위치하는지, 그리고 숙주 집단 전체에서 박테리아 보유 분포가 어떻게 되는지와 같은 공생 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

박테리아 균주를 하룻밤 동안 배양한 후, 항생제가 없는 영양 풍부 배지에 공여균, 수용균 및 헬퍼 균주를 배양액 대비 배지 비율 1:100로 계대 배양하고, 각 균주에 적합한 온도에서 대수 증식기 중간 단계에 도달할 때까지 배양합니다. 다음으로, 각 균주를 하나의 마이크로 원심분리 튜브에 혼합하고 17,900 Gs에서 2분 동안 원심분리합니다. 상층액을 따라내고 펠렛을 30 µL의 신선한 배지로 현탁합니다. 그런 다음 항생제가 없는 영양 풍부 배지 플레이트에 현탁액을 점적하고, 현탁액이 완전히 마를 때까지 기다립니다.

수용균에 최적이고, 해당되는 경우 공여균 및 헬퍼균이 생존 가능한 온도에서 플레이트를 뒤집어 밤새 배양합니다. 이제 스팟 부분을 긁어내어 선택적 항생제 플레이트에 단일 콜로니가 형성되도록 스트리킹하여, 분리를 위한 단일 콜로니의 순수 배양균을 얻습니다. 마지막으로, 생성된 콜로니가 공여 균주가 아닌 수용 심비언트(symbiant)인지 확인합니다.

수용체 특이적 표현형의 존재 여부를 스크리닝함으로써 확인합니다. 예를 들어, 카탈레이스 테스트를 수행하여 cino abdi 박테리아를 e coli와 구별할 수 있습니다. 형광 플라스미드 단백질에 해당하는 파장에서의 형광을 확인하여 플라스미드의 존재 여부를 스크리닝합니다. 천연 박테리아 공생체를 하룻밤 동안 배양한 후, 박테리아 배양액 600 µL를 8~10개의 10 mm 지질 아가 플레이트에 도말하고, 25 °C의 어두운 곳에서 습기가 없는 상태로 플레이트를 배양합니다.

이틀 후, 500 µL의 배지에 5,000마리의 감염성 유충(infective juvenile) 선충을 박테리아 층에 첨가합니다. 플레이트를 25 °C에서 3일 더 배양한 후, 현미경 슬라이드 위에 20 µL의 물을 떨어뜨립니다. 그다음 멸균 스틱을 사용하여 박테리아 층에서 소량의 선충을 긁어냅니다.

선충이 헤엄쳐 나올 수 있도록 스틱을 물에 넣습니다. 저배율로 이 슬라이드를 관찰합니다. 알과 암컷이 보이고 암컷 내부에 알이 포함되어 있다면, 플레이트 표면에 수 밀리리터의 물을 붓고 플레이트를 부드럽게 회전시킨 후 물을 50 milliliter 원추형 튜브에 붓습니다.

선충이 플레이트에서 떨어져 더 이상 플레이트 표면에 보이지 않아야 합니다. 선충이 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 기다린 후, 튜브 상단의 과잉수를 피펫으로 제거하고 깨끗한 물로 다시 채웁니다. 성체 선충이 가라앉을 때까지 기다렸다가 다시 한번 과잉수를 피펫으로 제거한 후, 원심 분리 튜브를 난액으로 채웁니다.

그 다음, 실온에서 정확히 10분 동안 튜브를 천천히 뒤집어 섞어줍니다. 혼합 후 즉시 원뿔형 튜브를 브레이크를 켠 상태로 실온에서 1,250 Gs로 정확히 10분 동안 원심 분리합니다. 그 후 상층액을 빠르게 따라내고, 피펫팅을 통해 펠릿을 난액(egg solution)으로 재현탁한 후 원뿔형 튜브에 신선한 난액을 채웁니다.

튜브를 3~5회 반전시켜 알 현탁액을 잘 혼합한 다음, 방금 보여준 것과 같이 즉시 알을 펠렛화하고 상층액을 따라냅니다. 피펫팅을 통해 펠렛을 misogyny broth 또는 LB에 재현탁한 후, 알 현탁액을 15 mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 이제 15 mL 튜브에 LB를 채우고, 방금 시연한 신속 단계 기술을 사용하여 배지에서 알을 3회 세척한 다음, 재현탁된 P nematode 알을 µL당 최소 10개 이하로 희석합니다.

알을 5 mL의 LB 배지와 정착 박테리아 억제용 항생제가 포함된 6 cm 페트리 접시에 옮깁니다. 플레이트는 하룻밤 동안의 배양과 형광 박테리아 선택 과정 후 파라필름으로 감싸 최대 4일 동안 보관할 수 있습니다. 멸균된 스틱을 사용하여 600 µL의 박테리아 배양액을 10 mm 지질 에어로에 도포하고, 25 °C에서 배양합니다.

2일 후, 각 지질 플레이트에 500에서 5,000개의 선충 알을 분주합니다. 플레이트를 보관해 두었다면, 이전에 준비한 박테리아 론(lawn)에 알을 접종하기 전, 앞서 시연한 대로 LB 15 milliliters로 알을 최소 한 번 세척하십시오. 그 후, 플레이트 가장자리에 감염성 유충이 흰색의 솜털 모양 고리로 나타날 때까지 선충-박테리아 공배양물을 습기가 없는 어두운 상태의 25 degrees Celsius에서 배양합니다.

감염성 2기 유충(infective juveniles)이 관찰되면, 지질 한천 플레이트의 덮개를 제거하고 플레이트 바닥을 비어 있는 100 mm x 20 mm 페트리 접시 바닥에 놓습니다. 그다음 페트리 접시에 작은 플레이트 높이의 약 절반 정도까지 닿을 만큼의 물을 채우고, 자손 감염성 2기 유충이 물속으로 나올 때까지 워터 트랩을 배양합니다.

물에서 선충을 수집하거나 적절한 세균 도말층에서 원하는 생애 단계의 선충을 수집한 후, ole 몇 알갱이를 30 µL의 물에 녹여, 선충 샘플 50 µL당 1~2 µL의 이 마비제를 첨가합니다. 그 다음, 마비된 선충 샘플 약 20~30 µL를 현미경 슬라이드 위로 옮기고 샘플 위에 커버 슬립을 덮습니다. 광학 현미경을 사용하여 선충이 시야 내에 있는지 확인합니다.

박테리아의 위치를 확인하기 위해, 광학 현미경 설정 외에 형광 현미경으로 선충을 촬영한 후 이미지들을 중첩시킵니다. 박테리아를 찾기 위해 선충의 여러 배율과 시야를 시도해야 할 수도 있습니다.

두 가지 배지에서 배양한 선충 집단의 수를 세고 세균 공생체의 정착 여부를 점수화하였습니다. 통계적 신뢰도를 확보하기 위해, 표에 제시된 바와 같이 샘플당 최소 100마리의 선충을 계수하고 각 카테고리마다 최소 30마리가 포함되도록 하는 것이 가장 좋습니다. 이 선충들은 지질 아가(lipid agar)에서 성장했을 때 약 14.6%, 간 및 신장 아가(liver, kidney agar)에서 성장했을 때 68.6%의 수준으로 정착되었습니다.

다른 선충 및 박테리아 종들은 서로 다른 수준의 군집 형성 능력을 갖는 것으로 나타났습니다. 이 모식도는 Steiner NEMA 암컷의 일반적인 외형을 보여줍니다. 삽입도는 20배 배율에서 촬영한 S fot 그래픽 암컷의 미분 간섭 대비 이미지를 보여줍니다.

삽입 그림의 검은색 화살표는 질을 나타내며, 흰색 화살표는 육안으로 확인되는 알을 나타냅니다. 이 이미지는 40배 배율에서 발달했으나 부화하지 않은 볼트 선충 알을 보여주며, 볼타 선충에서 분리된 이 알들은 10배 배율에서 촬영되었습니다. 여기 첫 번째 이미지에는 Xeno aptus 박테리아와 연관된 Steiner Nima 선충의 대표적인 현미경 이미지가 제시되어 있습니다.

이 합성 이미지를 제작하기 위해 GFP를 발현하는 박테리아 공생체와 결합된 Alvin의 선충을 관찰하였습니다. 위상차 이미지 위에 형광 이미지를 겹쳐 나타냈습니다. 화살표는 감염성 유충 선충 내에 존재하는 박테리아를 가리킵니다.

이 이미지는 GFP가 발현된 X nla를 가진 S carpa capsi 유충 선충을 보여줍니다. 이 이미지는 이전 이미지와 유사한 방식으로 제작되었으며, 선충의 장관 전체에 위치한 녹색 막대 형태로 시각화된 녹색 형광 단백질 표지 박테리아가 있는 유충 선충을 묘사합니다. 설명된 절차 외에도, 숙주-미생물 연합에 필요한 분자적 메커니즘은 무엇인지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 선충 숙주와 결합하기 전 박테리아 공생체의 유전적 조작과 같은 다른 방법들을 통합할 수 있습니다.