성인 마우스에서의 모터 단위 제작 룸버 Motoneuron과 포스의 동시 세포 녹화

이 절차의 전반적인 목표는 생체 내(in vivo)에서 운동 뉴런의 세포 내 기록을 수행하여 단일 마우스 운동 단위의 전기생리학적 및 수축 특성을 연구하는 것입니다. 이를 위해 먼저 척수와 대상 근육을 노출시킨 후, 근육의 힘줄에 힘 변환기를 부착합니다.

다음으로 세포 내 전극을 통해 운동 뉴런을 자극하여 기록된 운동 단위의 수축을 유도합니다. 결과적으로, 운동 뉴런의 전기생리학적 특성을 해당 운동 단위의 수축 특성과 동시에 규명할 수 있습니다. 동물의 크기가 매우 작아 미세 수술 단계를 습득하기가 매우 어렵기 때문에, 이 기술에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.

절차를 시작하려면, 펜토바르비탈 나트륨 또는 케타민과 자일라진 혼합물을 복강 내로 주입하여 마우스에 마취를 실시합니다. 마우스에게 발가락 꼬집힘 반사가 없는지 확인하십시오. 그다음, 뭉툭한 가위를 사용하여 기관 위를 절개하고 양쪽의 피부를 당겨 벌립니다.

그다음 뭉툭한 포셉(blunt forceps)으로 타액선을 떼어냅니다. 기관(trachea)을 덮고 있는 두 개의 얇은 근육을 노출시키기 위해, 두 근육을 분리하여 기관을 드러냅니다. 이때 Dumont 7번 포셉을 사용합니다.

4-0 aut silk 봉합사 두 가닥을 기관 아래로 통과시킵니다. 그 다음 두 연골 고리 사이의 기관을 횡단 절개합니다. 이때 기관이 완전히 절단되지 않도록 주의하십시오.

이제 기관 튜브를 기관 내부로 삽입합니다. 삽입구의 양쪽을 봉합사로 묶어 고정합니다. 그 다음, 기관 튜브를 마우스 인공호흡기와 캡노그래프에 연결합니다.

그 다음, 컴플라이언스 백을 통해 인공호흡기를 순수 산소에 연결합니다. 마우스가 인공 호흡에 저항하지 않도록 인공호흡기의 파라미터를 조정하고, 호기말 이산화탄소 분압이 4~5% 사이에서 안정적으로 유지되도록 합니다. 이 단계에서는 둔성 박리법을 사용하여 목 한쪽의 경정맥을 노출시킵니다.

경정맥은 전안면정맥과 후안면정맥이라는 두 개의 주요 줄기로 나뉩니다. 정맥을 주변 결합 조직으로부터 조심스럽게 분리하십시오. 그런 다음 6-0 silk suture 실 두 가닥을 정맥 아래로 밀어 넣고, 정맥의 길이를 따라 가능한 한 멀리 떨어뜨려 배치하십시오.

다음으로, 정맥의 근위측에 작은 혈관 클립을 배치하고 정맥의 원위측을 묶어줍니다. 매우 정밀한 아이리스 가위를 사용하여 정맥에 작은 횡절개를 가합니다. 이때 정맥이 완전히 절단되지 않도록 매우 주의하십시오.

그 후, 정맥과 카테터를 함께 고정하고 있는 혈관 클립까지 미리 채워진 1 French 카테터를 개구부에 삽입합니다. 혈관 클립을 조심스럽게 제거하십시오. 그런 다음 카테터를 정맥 안으로 몇 밀리미터 더 밀어 넣습니다. 삽입부 양측을 봉합사로 묶어 카테터를 고정합니다.

다음으로, 펜토바르비탈 나트륨(pentobarbital sodium) 또는 케타민 자일라진(ketamine xylazine)과 같은 마취제 보충 용량을 주입하기 위해 카테터 하나를 주사기 또는 주사 펌프에 연결합니다. 다른 정맥에 대해 동일한 절차를 반복하고, 나머지 카테터를 주사 펌프에 연결하여 1% 중탄산나트륨(sodium bicarbonate)과 14% 플라스몬(plasmon)이 포함된 4% glucose 용액을 서서히 정맥 투여합니다. 마지막으로, 봉합사를 이용하여 목 피부를 봉합합니다.

그 후, 마우스를 복와위(prone position)로 되돌립니다. 이제 허벅지 상단부터 아킬레스건까지 절개합니다. 피부를 하부 근육과 분리하며, 이때 혈관이 손상되지 않도록 주의하십시오.

다음으로, 허벅지를 따라 내려오는 흰색 선으로 보이는 대퇴이두근의 앞쪽 가장자리를 확인합니다. 그런 다음 무릎부터 골반뼈까지 해당 선을 따라 조심스럽게 절개합니다. 근육을 분리하여 대퇴이두근 아래에 있는 좌골신경을 노출시킵니다.

대퇴이두근을 조심스럽게 절개하여 제거합니다. 좌골신경과 삼두비복근을 노출시키기 위해, 총비골신경과 외측비복신경 사이에 위치한 경골신경을 확인합니다. 경골신경의 여러 분지 중에서 더 깊은 곳으로 들어가는 분지들과 구분하여 삼두비복근으로 이어지는 분지들을 확인합니다.

8 OTT 실을 사용하여, tricep surae에 분포하는 분지들은 유지하면서 경골 신경의 모든 분지들을 함께 묶습니다. 매듭에서 가능한 한 멀리 떨어진 지점에서 경골 신경을 절단합니다. 갈비뼈가 부착된 마지막 척추인 T 13과 L 1 척추를 식별합니다.

그 다음, T 13과 L 1의 양측에 Cunningham 척수 척추 클램프를 사용하여 척주를 고정합니다. 이때 척수를 압박하지 않도록 주의하면서, 종축 방향으로 약간의 장력을 가합니다. 포셉으로 부드럽게 눌러 척주가 단단히 고정되었는지 확인합니다.

미세 R-juror를 사용하여 가시돌기를 제거한 후, T 13 및 L 1의 추궁판을 제거하여 척수를 노출시킵니다. 그런 다음 척수를 둘러쌀 수 있도록 맞춤 제작된 플라스틱 욕조를 배치합니다. 그 후, 4-0 실크사로 욕조를 고정합니다.

마지막으로, 퀵 캐스트 실런트로 밀봉하여 배스의 방수 상태를 확인하십시오. 퀵 캐스트가 건조되면 척수를 덮고 있던 솜을 제거하고 배스에 미네랄 오일을 채웁니다. 다른 척추 클램프를 사용하여 천골 부위의 극돌기를 고정하십시오.

동물의 등 부위를 지지하기 위해, 세 번째 클램프를 사용하여 오른쪽 뒷다리와 발목을 무릎과 발목이 각각 90도 각도로 굽혀진 상태로 고정합니다. 뒷다리 부위를 덮고 있는 거즈를 제거합니다. 주변 조직으로부터 아킬레스건을 박리합니다.

실을 꿴 바늘을 사용하여 삼두근을 주변 조직으로부터 최대한 절단합니다. 6-0 실크 봉합사를 아킬레스건에 통과시킨 후 건 주변에 세 번 매듭을 짓습니다. 그다음 매듭 근처에 힘 변환기(force transducer)를 배치합니다.

그 후, 실크사를 사용하여 힘 변환기(force transducer)에 힘줄을 부착하고, 힘줄의 원위부를 절단합니다. 다음으로, 가자미근(tricep sury muscles)의 근막 아래에 두 개의 스테인리스 스틸 와이어를 삽입합니다. 이 와이어들은 세포 외 AC 증폭기에 연결됩니다.

EMG 기록을 위해 tricep sury nerve를 훅 전극의 음극에 배치하고, 양극은 인접한 근육에 접촉시킵니다. 그런 다음 최대 수축 진폭이 관찰될 때까지 낮은 주파수에서 강도를 높여 50 microsecond 사각 펄스로 tricep sury nerve를 자극합니다. 이어서 최대 수축 진폭이 관찰될 때까지 낮은 주파수에서 강도를 높여 50 microsecond 사각 펄스로 tricep sury nerve를 자극합니다.

이 그림들은 삼두근(tricep sury) 그룹에서 운동 뉴런을 식별하는 방법을 보여줍니다. 낮은 자극 강도에서 침투시킨 후, 더 높은 강도에서만 단일 시냅스 EPSP가 관찰될 수 있습니다. EPSP는 훨씬 더 높은 자극 강도에서 정방향 스파이크를 유발할 만큼 충분히 클 수 있으며, 이는 '전무 아니면 전부(all or none)' 법칙을 따릅니다.

역방향 스파이크(Antidromic spike)는 단일 시냅스 EPSP보다 더 짧은 잠복기로 나타납니다. 미세 전극을 통해 스파이크를 유발하기에 충분한 전류가 주입되면, 짧은 지연 시간 후에 근육에서 EMG 활성이 기록되고 이어서 근육 수축이 일어납니다.

운동 신경세포를 식별한 후, 해당 세포의 전기생리학적 특성을 분석할 수 있습니다. 예를 들어, 이 그림은 과분극 및 탈분극 전류 펄스를 사용하여 입력 저항을 측정하고, 주입된 전류량에 따른 막 전위의 변화를 그래프로 그리는 방법을 보여줍니다. 또한, 다양한 자극 프로토콜을 사용하여 운동 단위의 수축 특성을 연구할 수 있습니다.

예를 들어, 운동 신경세포에 다양한 빈도로 짧은 전류 펄스를 주입하여 힘-빈도 관계를 얻을 수 있습니다. 그 후 정상 상태의 힘을 전류 펄스의 빈도에 대해 도식화하면 S자형의 힘-빈도 곡선이 나타납니다. 수술 기법을 완전히 익히고 완벽하게 수행한다면, 이 기술의 일부 과정은 3시간 이내에 완료될 수 있습니다.