면역 반응과 수면에서의 양적 측정

다음 실험의 전반적인 목적은 초파리의 수면 및 면역 기능을 평가하는 것입니다. 우선 감염된 초파리의 운동 활성도를 기록하여 수면 상태를 측정하고, 두 번째 단계로 감염된 초파리를 균질화 및 희석한 후 LB 한천 배지에 도말하여 생존율을 측정합니다. 성장한 콜로니 형성 단위(CFU)의 수는 감염원을 제거하는 초파리의 능력을 나타냅니다.

다음으로, NF kappa b 루시페레이스 리포터를 포함하는 트랜스진을 발현하는 감염된 초파리를 루시페레이스의 기질인 luciferian이 포함된 96웰 플레이트에 넣습니다. kappa b 루시페레이스의 실시간 측정은 감염 중 NF kappa B 신호 전달 경로의 활성화를 나타내며, 이는 전반적인 수면 생존 결과와 연관됩니다. 박테리아 제거율과 NF KB 리포터 활성은 면역 기능과 행동 사이의 분자적 연결 고리에 대한 기전적 통찰을 제공하는 측정값입니다.

일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 개인들은 파리에 수동으로 일관성 있게 감염시키는 방법을 배우는 데 시간과 연습이 필요하기 때문에 어려움을 겪습니다. QPCR과 같은 기존 방법보다 Lucifer 보고 기술의 주요 장점은 살아있는 파리에서 NF Kappa B 활성을 실시간으로 지속적으로 측정할 수 있다는 점입니다. 성체가 환경 조건에 적응할 수 있도록 후기 번데기 단계의 drosophila 배양액을 3~4일 동안 배양하는 것으로 시작하십시오.

여기에서는 면역 반응과 행동에 미치는 생체 시계의 영향을 제거하기 위해 초파리를 지속적인 빛 조건 하에 둡니다. 다음으로 1~4일 된 초파리를 활동량 측정기에 넣습니다. 모니터는 예정된 감염일 전날부터 감염 전까지 최소 3일 동안 초파리의 활동량을 기록합니다.

멸균된 피펫 팁으로 단일 SIA 콜로니를 선택하고, 팁을 5 mL의 LB 배지가 들어 있는 배양 튜브에 담가 멸균 기술을 확인하십시오. 박테리아가 없는 대조군 모의 배양(mock culture)을 만드는 것을 잊지 마십시오. 다음 날 박테리아가 지수 성장기에 도달할 때까지 하룻밤 동안 배양하십시오.

600 nm에서 배양액의 흡광도를 측정합니다. 두 번째 Q vet을 공시료(blank)로 사용하십시오. 흡광도 농도가 0.5에서 1 absorbance unit 사이가 되면 준비가 된 것이며, 필요한 경우 배양 시간을 연장하십시오.

이제 초파이를 감염시킬 박테리아 용액을 준비합니다. 600nm에서 흡광도가 0.1이 되도록 PBS로 박테리아를 희석합니다. 그런 다음 주입 대조군을 위해 식용 색소를 첨가합니다.

박테리아를 LB 배지로 교체합니다. 두 용액을 모두 얼음에 보관하십시오. 다음으로, 해부 현미경 하에서 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 끝이 미세한 주입 바늘을 제작합니다.

정밀 핀셋을 사용하여 각 바늘의 끝을 부러뜨려, 흡입을 통해 주입액을 채우기에 충분히 크면서도 초파리에 가해지는 손상을 최소화할 수 있을 만큼 작은 구멍을 만듭니다. 유리 바늘을 튜브 조각을 이용해 3 cc 플라스틱 주사기에 연결합니다. 주입액의 흐름은 수동으로 조절합니다.

주사기 장치는 감염 주입과 대조 주입 모두에 사용되므로, 고무 튜브가 주입액으로 오염되지 않도록 주의하십시오. Kim wipe 티슈를 사용하여 주입 배지의 흐름을 확인하십시오. 성공적인 주입을 위한 두 가지 핵심 사항은 최적의 바늘 크기를 사용하는 것과 바늘과 주사기 사이를 단단히 밀봉하는 것입니다.

주입 시스템 준비가 완료되면, 최소한의 이산화탄소 유량을 사용하여 초파리를 마취시키고, 마취된 초파리가 5분 이상 방치되지 않도록 신속하게 진행하십시오. 이제 유리 바늘을 등쪽 흉부의 scutellum 상단 부위에 찔러 넣어 초파리에 주입합니다. 주입액이 주입되면서 식용 색소가 퍼지는 것이 보이면, 주입 배지가 초파리 내부로 들어갔음을 확인할 수 있습니다.

시작하기 전, 본 실험 절차에 사용되는 모든 재료가 최소 하루 전에 오토클레이브 멸균되었는지 확인하십시오. 10 cm 페트리 접시에 LV 한천 배지를 준비합니다. 실험 당일에 초파리를 마취시킨 후 1.5 mL 원심 분리 튜브에 넣습니다.

실험 조건당 최소 10마리의 초파리로 구성된 두 그룹 이상을 준비하십시오. 특히 항생제 내성이 없는 세균 균주를 사용하는 경우, 감염되지 않은 초파리 대조군도 함께 준비하십시오. 시료가 담긴 모든 튜브는 얼음 위에 보관하십시오.

다음으로, 파리가 들어 있는 각 튜브에 LB 배지 400 µL를 추가합니다. 오염을 방지하기 위해 화염 근처에서 작은 페이스트를 사용하여 파리를 균질화합니다. 이제 절단된 피펫 팁을 사용하여 균질물을 200 µL 부피로 10배씩 단계 희석합니다.

sia 감염 직후에 균질물을 만들었다면 희석 배수를 1:1000까지 하고, 감염 24시간 후의 균질물이라면 1:100,000까지 희석합니다. 다음으로, 유리 구슬을 사용하여 균일하게 분산되도록 하여 가장 높은 희석 배수 두 가지를 10cm 플레이트에 접종하고, 플레이트를 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 직접 관찰하거나 콜로니 계수 소프트웨어를 통해 플레이트 위의 콜로니 수를 측정합니다.

그런 다음 파리 한 마리당 콜로니 형성 단위(colony forming units) 수를 계산하십시오. 이 분석법은 적절한 시점에 kappa b luciferase 리포터를 가진 형질전환 파리를 사용합니다. 또한 이 분석법에는 이전 섹션에서 설명한 대로 주입을 위해 준비된 SCIA와 같은 배양 박테리아가 필요합니다.

초파리를 실험 조명 조건에 적응시킵니다. 이 예시에서는 1~4일 된 kappa b luciferase 초파리를 5% sucrose, 2% agar 먹이 배지가 들어있는 바이알에 넣어 2일 동안 지속적인 광조사 조건에 둡니다. 이제 초파리를 위한 96웰 마이크로플레이트를 준비합니다.

각 웰에 두 층의 먹이를 채웁니다. 먼저 5%sucrose, 2%agar 용액 300 µL를 각 웰에 추가합니다. 미세 메쉬 천으로 플레이트를 덮고 최대 1시간 동안 플레이트를 완전히 건조시킵니다.

다음으로, 5% sucrose, 1% agar 및 2 mM Lucifer가 포함된 50 µL의 상층액을 각 웰에 추가합니다. Lucifer는 빛에 민감하므로, 이후 과정부터는 플레이트를 암소에서 건조시키고 빛 노출을 최소화하십시오.

한천이 식으면 투명 접착 필름으로 플레이트를 덮습니다. 그런 다음 가는 바늘을 사용하여 각 웰 위의 필름에 두 개의 구멍을 뚫습니다. 이 구멍들은 공기 교환과 가스 마취가 가능하게 합니다.

다음으로, 파리 투입을 용이하게 하기 위해 날카로운 칼날과 직선자를 사용하여 각 열 사이에 절개선을 넣습니다. 이산화탄소로 파리를 마취시킨 후, 열 단위로 각 웰에 한 마리씩 투입합니다. 파리가 필름에 붙었을 경우, 직접 개입하기 전에 파리가 스스로 벗어날 수 있도록 시간을 줍니다.

마이크로 웰 플레이트를 지속적인 조명 조건의 인큐베이터에 8~24시간 동안 다시 넣어둡니다. 웰에 고정된 초파리를 마취시키려면 저압 이산화탄소 라인에 연결된 마이크로 피펫 팁을 사용하십시오. 가스가 무해한 저압 상태인지 확인하고, 8마리씩 그룹으로 나뉜 초파리를 개별적으로 마취시키기 위해 환기 구멍 바로 위에 마이크로 피펫 팁을 배치하십시오.

각 초파리를 CO2 패드로 옮기고 이전과 동일하게 박테리아를 감염시킵니다. 그런 다음 각 초파리를 원래의 웰로 되돌리고 마이크로플레이트를 다시 밀봉합니다. 정해진 조명 일정에 따라 온도 조절실에 설치된 루미노미터를 사용하여 각 초파리의 발광량을 측정합니다.

플레이트를 스태킹 카세트에 넣으며, 초파리가 들어 있는 플레이트 사이에 투명한 공플레이트를 배치하십시오. 제조사의 사양에 따라 루미노미터를 프로그래밍하고 최소 24시간 동안 매시간 측정값을 수집합니다. 본 예시에서는 검출기가 각 웰을 10초 동안 읽도록 프로그래밍되었습니다.

완료되면 데이터 파일을 스프레드시트로 내보내고 결과 그래프를 그려 표준 분석을 수행합니다. 예시 데이터를 분석할 수 있습니다. 웰당 3회 측정값의 평균 초당 감소량을 산출합니다.

Canton S 야생형 초파리와 NF kappa B 유전자가 결핍된 relish. E 20 돌연변이 초파리를 지속적인 광조건의 활동 모니터 두 곳에 넣고 sia를 감염시켰습니다. 이 예시에서는 감염이 수면을 촉진했습니다.

relish E 20 돌연변이체는 감염 후 Canton s. 대조군 파리보다 수면 시간이 더 짧은 것으로 나타났습니다. 이전의 연구 결과와 일치하게, relish E 20 돌연변이체는 야생형 파리에 비해 감염 후 빠르게 사멸하였습니다.

무균 대조군 주입 후 대부분의 파리가 생존하였으며, 이는 파리가 주입으로 인한 상처가 아니라 감염으로 인해 사망했음을 나타냅니다. relish 돌연변이체는 매우 빠르게 사망했기 때문에, 감염 후의 세균 수치를 증명하는 데에는 Canton s 파리만 사용되었습니다. Sia는 감염 24시간 후에도 파리 체내에서 계속 증식했습니다.

루시퍼레이스 리포터 활성은 개별 파리 간 및 데이터 포인트의 성공 여부에 따라 큰 편차를 보였습니다. 신호는 파리 내의 모든 조직에서 유래하지만, 모든 조직이 동일한 양의 신호를 방출할 것으로 기대되지는 않으며, 파리가 움직임에 따라 검출기에 노출되는 조직의 가시성이 달라질 수 있습니다. 본 예시에서는 파리를 감염시킨 후 처리된 대조군과 비교하였습니다.

사망한 파리는 그룹별 분석에서 제외되었습니다. 감염 후 Kappa b Luciferase 리포터 활성이 지속적으로 증가했습니다. 무균적 손상 후에도 Kappa b Luciferase 리포터의 활성이 지속적으로 증가했습니다.

손상 후와 감염 후 모두 정점 활성은 약 12시간 전후로 나타났습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 감염 후 SSO에서 면역 기능과 수면을 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다. 우리는 수면, 생존, 시간, 박테리아 제거 및 un copy 전사 리포터의 실시간 활성을 측정할 수 있습니다.