이 절차의 전반적인 목표는 패치 클램프 기록을 수행하기 위해 쥐의 뇌에서 F1 F zero APA 소포를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 쥐로부터 뇌를 적출하여 균질화함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 압력을 가하여 시냅스 구역을 파괴하는 것입니다.

다음으로, 시냅토솜을 파이알 구배(phial gradients) 위에 층상으로 올립니다. 마지막 단계는 digitonin 및 L과 함께 배양하여 패치 클램프 기록을 위한 최종 소포를 얻는 것입니다. 미토콘드리아의 중요한 기능 중 하나는 산화적 인산화를 통한 ATP 생성입니다.

ATP 생성의 책임이 있는 효소는 미토콘드리아 내막에 위치한 ATP 합성효소입니다. ATP 합성효소의 기능을 상세히 연구하기 위해, 당사는 SMV라고 부르는 특수한 하위 미토콘드리아 소낭을 분리합니다. 이들은 ATP 합성효소 효소를 안팎이 뒤집힌 형태로 포함하고 있습니다.

그런 다음 패치 클램프 전극을 사용하여 이러한 SMV를 기록하고, 막의 누출도를 측정합니다. 이를 통해 미토콘드리아의 TP 생성 효율을 알 수 있습니다. 오늘 이 과정을 시연할 사람은 예일 대학교 제 실험실의 박사후 연구원인 Sylvia ti입니다.

본 절차에서는, 참수로 쥐의 머리를 얻은 후 피부를 절개하여 두개골을 노출시키고, 가위나 Rons를 사용하여 두개골을 조심스럽게 절개하여 엽니다. 이어서 뇌를 적출하고 소뇌를 제외한 뇌 조직을 잘게 다진 후 최종적으로 격리된 버퍼 내에서 분리합니다. 그 다음, 조직을 5 mL 유리 테플론 균질기에 옮겨 약 5분 동안 총 10회 조심스럽게 균질화합니다. 이후 벤치탑 원심분리기를 사용하여 4 °C에서 1,500 ×g로 10분간 시료를 원심분리합니다.

미토콘드리아와 시냅토좀이 포함된 상층액을 회수하고 펠릿은 제거합니다. 그런 다음 벤치탑 원심분리기를 사용하여 4°C에서 16,000 ×g로 10분 동안 다시 원심분리합니다. 다음으로 상층액을 제거하고 펠릿을 500 µL의 분리 버퍼(isolation buffer)에 재부유시킨 후, 세포 파쇄 용기(cell disruption vessel)를 사용하여 1,200 PSI의 압력을 10분 동안 가해 시냅토좀을 파쇄하고 빠르게 감압합니다. 파쇄된 시냅토좀을 두 가지 서로 다른 농도의 피콜(Fial)이 들어 있어 두 개의 층을 형성하는 원심분리관 위에 층층이 쌓습니다.

다음으로 튜브를 SW 50.1 로터에 넣고 4°C에서 126,500 ×g로 20분 동안 원심분리합니다. 초원심분리기를 사용하면 펠릿 부분은 정제된 미토콘드리아가 됩니다. 층별 밀도 차이 사이에 형성된 층은 파괴되지 않은 시냅토좀입니다.

그 후, 분리 완충액으로 펠릿을 세척합니다. 벤치탑 원심분리기를 사용하여 4°C에서 16,000 ×g로 10분간 원심분리하십시오. 그런 다음, 미토콘드리아를 200 µL의 분리 완충액과 동일한 부피의 1% digitonin 혼합액에 재현탁합니다.

얼음 위에 15분 동안 둡니다. 다음으로, 분리 버퍼를 더 추가하고 4°C에서 16,000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 이 과정을 두 번 반복한 후, 펠렛을 200 µL의 분리 버퍼에 재현탁시키고, 10% Lybra PX 믹스 2 µL를 추가하여 얼음 위에 15분 동안 둡니다.

그 후, 혼합물을 분리된 버퍼가 담긴 원심분리 튜브에 층층이 쌓습니다. 튜브를 SSW 50.1 로터에 넣고 4°C에서 182,000 ×g로 1시간 동안 원심분리합니다. 1시간 후에.

최종 펠릿을 분리 버퍼(isolation buffer)에서 4°C, 16,000 ×g로 10분 동안 원심분리하여 세척합니다. 일반적인 전기생리학 장비는 증폭기, digi data 1, 440이 장착된 PC 컴퓨터, P clamp 10.0 소프트웨어와 연동되는 아날로그-디지털 변환기 인터페이스, 조작기, 현미경, 진동 절연 테이블 및 패러데이 케이지로 구성됩니다. 먼저, 화염식 brown 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 붕규산 유리 모세관에서 피펫을 뽑아냅니다.

피펫의 최적 저항은 80에서 100 MΩ 사이여야 합니다. 생리학적 세포내 용액에 하위 미토콘드리아 소포를 첨가하십시오. 그 다음 패치 클램프 피펫을 동일한 용액으로 채우십시오.

위상차 현미경으로 소포를 관찰합니다. SMV 패치 클램핑은 상온에서 수행합니다. 막전위를 -100 mV에서 +100 mV 범위까지 각각 10초 동안 유지하며 활성을 기록합니다.

기록된 데이터는 증폭기 회로를 사용하여 5 kHz에서 필터링되며, clamp fit 10.0 소프트웨어로 분석합니다. 이 그림은 세포질과 미토콘드리아에서 준비한 용해물의 블롯을 보여줍니다. 상단 패널은 세포질 단백질인 GA dh에 대한 항체를 이용한 면역 블롯을 보여줍니다.

하단 패널은 미토콘드리아 내막 단백질인 Cox four에 대한 항체를 사용한 블롯을 보여줍니다. 여기에는 1 mM ATP 첨가 전후의 대표적인 패치 클램프 기록 두 가지가 제시되어 있습니다. 유지 전위는 +70 mV입니다. 점선은 0 pA를 나타냅니다.

각 트레이스는 10초 동안 기록되며, 트레이스 사이에는 10초의 간격이 있습니다. 다음은 SMV가 존재할 때, 그리고 TP가 없을 때와 있을 때의 시간 경과에 따른 CMA 지시약의 형광 강도 변화를 나타낸 예시 트레이스입니다. 이 영상을 시청하고 나면 미토콘드리아와 F1 FO 80 TP Synthes를 포함하는 하위 미토콘드리아 소포를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 또한, 소포 막에 전극을 사용하여 I 저항성 씰을 형성하고 ATP Syntase Complex의 채널 활성을 분석하는 방법을 이해하게 될 것입니다.