대량 세포 계측법 : CyTOF 질량 Cytometer에 매일 조정하고 실행 세포 샘플에 대한 프로토콜

이 절차의 전반적인 목표는 CyTOF 장비의 적절한 일일 튜닝 및 시료 분석 방법을 시연하는 것입니다. 먼저, 장비를 조립하고 전원을 켭니다. 그다음, 최대 신호를 얻기 위해 튜닝을 위한 장비 설정을 최적화합니다.

이제 기기는 샘플을 분석할 준비가 되었습니다. 마지막 단계에서는 기기를 세척하고 전원을 끕니다. 결과적으로, 특정 시간 요구 사항에 따라 최적의 세포 데이터를 얻을 수 있습니다.

이 기술에 대한 시각적 시연은 매우 중요합니다. 매일 수행하는 설정, 튜닝 및 세척 절차는 매뉴얼만으로는 습득하기 어렵습니다. 이는 동시에 여러 소프트웨어 단계가 수반되기 때문입니다.

적절한 배경 수준과 신호 강도에 대한 감을 익히기 위해 경험을 쌓아야 합니다. 실험을 시작하기 최소 15분 전에 CyTOF 소프트웨어 프로그램을 열고 기기 설정(instrument setup)을 선택하십시오. 그런 다음 카드 케이지(card cage) 탭에서 히터 켜기(heater on) 버튼을 클릭하여 스프레이 챔버 맨틀의 온도가 200 °C에 도달하도록 하십시오.

시린지 펌프의 시린지를 milli cube water가 채워진 새 시린지로 교체하십시오. 그 다음, 각 포트를 통해 5% Citron으로 두 번 역세척하여 네뷸라이저를 세척하십시오. 잔류 Citron을 제거하기 위해 Milli Q water로 역세척을 반복하십시오.

다음으로, 아르곤 가스 탱크 밸브를 열면 기기 전면의 아르곤 표시등이 켜집니다. 그런 다음 네뷸라이저를 메이크업 가스 주입구에 연결하고, 네뷸라이저를 액체 도입 튜브에 연결하십시오. 기기 설정 창의 RFG 컨트롤러 탭에 있는 가열 맨틀의 흰색 개구부에 네뷸라이저 끝부분을 삽입하십시오.

'plasma 시작'을 클릭한 다음 '확인'을 클릭하십시오. 시작 과정이 완료되면 팝업 창에서 다시 '확인'을 클릭하십시오. 이제 시린지 펌프의 전원을 켜십시오.

시린지를 다시 채울 때는 일시 정지 버튼 대신 정지 버튼을 눌러 부피 카운터를 리셋하십시오. 질량 세포 분석기(mass cytometer)를 교정하기 전에, 반드시 20분 동안 예열되었는지 확인하십시오. 기기가 안정화되면, 데이터 획득 설정 버튼을 클릭하여 데이터 획득 설정 창을 엽니다. 분석물 탭에서.

주기율표를 클릭하여 동위원소 선택 패널을 엽니다. 그런 다음 매뉴얼에 나열된 DVS sciences 튜닝 솔루션의 동위원소를 선택하고 저장(save)을 클릭합니다. 다음으로, 읽기당 동위원소(isotopes per reading) 버튼을 클릭하여 읽기당 질량 창을 엽니다.

펄스 수를 선택하고 새 숫자를 입력한 후 enter 키를 눌러 y축의 배율을 조정하십시오. 이제 1 mL 정량 주입 시린지에 튜닝 용액을 채웁니다. 샘플 포트 선택기를 load로 돌리십시오.

튜닝 용액 450 µL를 주입한 다음, 셀렉터를 inject 방향으로 돌립니다. 튜닝 용액의 동위원소들이 디스플레이에 스트리크 형태로 나타나기 시작할 때까지 기다리십시오. 비행 시간(time of flight) 9,400에서 9,800 영역의 신호는 아르곤 가스 내의 xenon 동위원소로 인해 발생하는 것입니다.

이제 판독 창당 질량 화면으로 돌아가 녹색 재생 버튼을 클릭하십시오. 각 색상 선은 분석물 탭에서 선택한 동위원소를 나타냅니다. 동위원소 수준이 안정되면, 데이터 획득 설정 창의 파라미터 탭에 있는 드롭다운 메뉴에서 현재 전류를 조정하십시오.

시작 창에서 종료(finish) 값에 10을 입력하고, 시작 값에 0을 입력하십시오. 단계(step) 값에는 0.5를, 침강 시간(settling time)에는 200을 입력하십시오. 그런 다음 저장(save)을 클릭하십시오.

그런 다음 읽기당 질량(masses per reading) 창을 다시 클릭하고 재생을 누릅니다. 동위원소 신호가 정점에 도달하는 지점을 확인한 후, 기기 설정 창의 DAC 채널 설정 탭으로 이동합니다. 아래로 스크롤하여 전류(current) 항목을 찾아 동위원소 피크 값을 입력하십시오.

실제 전류 값 설정(set actual current value)을 클릭한 다음 저장하십시오. 다음으로, 드롭다운 메뉴를 메이크업 가스(make up gas)로 변경하십시오. 시작 창에 0.55, 종료 창에 0.95, 단계 값 창에 0.05, 안정화 시간 창에 200을 입력하십시오.

저장을 클릭하십시오. 질량당 판독 창으로 돌아가 재생을 다시 클릭하면 x축에 보정 가스 유량이 표시됩니다. 동위원소 신호가 정점에 도달하는 값을 기록하고, 마지막 부분에서 GD 1 55 신호가 급격히 증가하는 것을 관찰하십시오.

그 다음 DAC 채널 설정 탭으로 돌아갑니다. makeup gas 항목으로 스크롤을 내려 새로운 동위원소 피크 값을 입력합니다. set actual current value를 클릭합니다.

그 다음, 다시 저장(save)을 클릭하여 원하는 동위원소 대비 산화물의 비율을 기록합니다. 먼저, 튜닝 용액을 450 µL 두 번째로 주입합니다. 그 후 파라미터 탭에서 드롭다운 메뉴의 시간(time)을 선택하고, 시작(start) 창에 0, 종료(end) 창에 10, 단계 값(step value) 창에 1, 그리고 안정화(settling) 창에 200을 입력합니다.

masses per reading 창에서 재생 버튼을 클릭한 후, 커서를 사용하여 TM 1 69 또는 TB 1 59의 더 높은 값과 GD 1 55 값을 읽으십시오. 이제 샘플 루프를 통해 3 mL의 Milli Q water를 주입한 다음, 500 µL의 DVS 세척액을 주입하십시오. mass calibration 탭에서 run을 클릭하여 스트리크의 강도가 감소하기 시작할 때까지 세척 과정의 진행 상태를 모니터링하십시오.

그다음 3 mL의 milli-Q water를 넣고 스트리크(streak)가 배경 수준으로 낮아질 때까지 모니터링합니다. 앞서 시연한 샘플 동위원소를 튜닝 용액 동위원소 란에 입력한 후 저장 버튼을 클릭합니다. 다음으로 분석 창을 열고 샘플 부피에 맞게 분석 설정을 변경합니다.

예를 들어, 450 µL의 샘플은 샘플 루프를 채우게 되며, 세포 데이터 획득 시 발생하는 지연 시간을 고려하여 600초 동안 작동하게 됩니다. 작동 전 획득 지연 시간(acquisition delay)을 최소 30초로, 검출기 안정화 지연 시간(detector stability delay)을 최소 20초로 설정하십시오. 세포 샘플을 milli cube water로 최소 2회 세척한 다음, 샘플을 최대 10⁶ cells/mL 농도로 재현탁하고, 이렇게 만들어진 세포 용액을 35 µm 세포 스트레이너로 여과하십시오.

응집물을 제거하기 위함입니다. 이제 현재 샘플에 대한 새 파일 이름을 입력하십시오. 모든 파일은 반드시 E 드라이브에 저장해야 함에 유의하십시오.

그런 다음 샘플 루프 밸브를 로드(load) 위치로 전환하여 샘플을 주입하고, 샘플 루프 밸브를 다시 주입(inject) 위치로 전환한 다음 실행(run)을 클릭합니다. 획득 창에서 세포는 스냅샷 창의 각 수직 동위원소 채널에 수평 방향의 표시 집합으로 나타나며, 여기에서 보여주는 바와 같이 초당 약 300에서 500개의 세포일 때 최적의 해상도를 나타냅니다.

시료의 데이터 수집이 완료되면 팝업 창이 나타납니다. 확인(okay)을 클릭하여 시료 분석 완료를 확정하고, 기기를 세척하여 시료 간의 오염(carryover)을 최소화하기 위해 각 시료 사이에 최소 500 µL의 MQ water를 주입하십시오. 사용 후에는 450 µL의 세척 용액을 시료 루프에 주입하십시오. 유리 금속의 방출을 모니터링한 다음, 배경 스트릭 레벨(background streak levels)에 도달할 때까지 세척 상태를 확인하며 3 mL의 milli Q water로 시료 루프를 플러싱하십시오.

그런 다음 기기를 종료하려면 기기 설정 창의 RFG 컨트롤러 탭을 선택하고 plasma 정지 버튼을 클릭하십시오. 절차가 완료되면 팝업 창에서 확인을 클릭하며, 카드 케이지 탭에서 네뷸라이저 제거를 권장합니다. 가열기를 끄고 아르곤 공급 밸브를 잠근 후, 네뷸라이저를 조심스럽게 뒤로 당겨 스프레이 챔버에서 분리하십시오.

다음으로, 시료 도입 튜빙을 풀어서 옆으로 치워 둡니다. 메이크업 가스 도입 연결부를 약간 느슨해질 때까지 푼 다음, 네뷸라이저를 당겨서 분리합니다. 마지막으로, 앞서 시연한 것과 동일한 주사기와 튜빙을 사용하여 5% Citron으로 네뷸라이저의 양쪽 포트를 세척하고, 다음 사용 때까지 네뷸라이저를 5% Citron으로 덮어 보관합니다.

UE water와 DVS 세척 용액으로 mass cytometer를 적절히 세척하면 튜빙 및 기기의 다른 부품으로의 금속 흡착 수준을 낮추어, 이 그래프들에서 보이는 것과 같은 배경 신호를 줄이는 데 도움이 됩니다. 자홍색 선으로 표시된 부적절한 튜닝의 경우, 진한 파란색 선으로 표시된 적절하게 튜닝된 샘플과 비교했을 때 m+16에서의 산화물 형성이 현저히 증가했습니다. 이는 m에서의 원하는 신호를 약간 감소시키고, m+16에서의 원치 않는 배경 간섭을 크게 증가시키는 결과를 초래합니다.

Milli Q water를 이용해 시료를 적절히 세척하고 희석하면 속도를 유지하면서도 배경 신호를 최소화하고 세포 해상도를 최대로 높일 수 있습니다. 본 실험에서 보여주는 대표적인 실험 데이터와 마찬가지로, 천연 존재비의 lanthanum 139, barium 140, terbium 159, erbium 169 및 lutetium 175를 포함하는 폴리스티렌 비드를 세포 획득 모드에서 분석하였습니다. 데이터는 FlowJo를 사용하여 분석하였으며, 파손된 비드에서 발생한 파편은 게이팅을 통해 제거하였습니다.

적절하게 튜닝된 시료는 진한 파란색 선으로 표시된 0.74 liters per minute 유량일 때인 것으로 확인되었습니다. 낮은 유량일 때보다 이 유량에서 더 높은 신호 강도가 관찰되었으며, 적절하게 튜닝된 시료는 부적절하게 튜닝된 신호보다 M 금속 질량에서 더 높은 신호를 보이고 m plus 16 산화물 질량에서는 더 낮은 신호를 보이는 것으로 관찰되었습니다. LANTHANUM 1 39 및 THULIUM 1 69의 M 질량 신호를 확대한 모습이 여기에 표시되어 있습니다.

메이크업 가스 유량이 LANTHANUM 1 39 신호 강도에 thulium 1 69 신호 강도보다 더 큰 영향을 미친다는 점에 유의하십시오. 이 그래프들은 각각 LANTHANUM 1 39 plus oh 16 및 thulium 1 69 plus oh 16 산화물에 해당하는 m plus 16 산화물 질량 1 55 및 180 5에서의 신호를 보여줍니다. lanthanum 1 39가 thulium 1 69보다 더 쉽게 산화되기 때문에, 메이크업 가스 유량이 질량 180 5 신호보다 질량 1 55 신호를 훨씬 더 증가시킨다는 점에 유의하십시오.

메이크업 가스 유량에 따른 m 및 m plus 16 신호 강도가 여기에 표시되어 있습니다. 채워진 아이콘은 질량 M을 나타내며, 빈 아이콘은 질량 M plus 16을 나타내고, 선의 색상은 각각의 질량 M에 대응합니다. LANTHANUM 1 39 및 price ODIUM 1 41의 신호 강도가 메이크업 가스 유량에 의해 크게 영향을 받는다는 점에 유의하십시오. 심지어 질량 M보다 질량 m plus 16 산화물이 더 많이 존재하는 지점에 도달하기도 합니다. 이 영상을 시청하신 후에는 CyTOF를 적절하게 가동하고 튜닝하며, 샘플을 분석하고, 마지막으로 일일 분석 종료 후 장비를 적절하게 세척하고 종료하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.