항원 특정 규제 트랜스 생체 지연 형 과민 분석

이 실험 절차의 전체적인 목표는 trans vivo DTH 분석법을 사용하여 인간 피험자의 항원 특이적 염증성 및 항염증성 반응을 모두 모니터링하는 것입니다. 먼저, 인간 피험자의 말초혈액에서 말초혈액 단핵세포를 분리합니다. 그런 다음, 분리된 PBMC 준비물을 PBS와 혼합합니다.

리콜 항원 테스트 항원 및 테스트 항원과 리콜 항원 혼합물을 준비합니다. 발바닥 사전 측정 단계를 진행하고 준비된 혼합물을 SKID 마우스에 주입합니다. 24시간 후에 발바닥 재측정을 수행합니다. 셋.

지연형 과민반응(DTH) 반응의 결정적인 패턴은 조절성, 비조절성 및 민감화된 반응으로 가능합니다. trans vivo 지연형 과민반응 분석법은 항원의 소스가 이식 공여자의 세포인 동종 반응 반응과 같은 임상 파라미터를 결정하는 데 적용될 수 있습니다. 기존의 in vitro 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 단일 분석 시스템을 사용하여 동종 항원, 자가 항원 또는 종양 항원에 대한 염증 촉진 반응과 조절 반응을 모두 쉽게 검출할 수 있다는 점입니다.

제 실험실의 연구원인 Egon이 혈소판 활성화를 방지하기 위해 acid citrate dextrose 튜브에 수집한 신선한 인간 말초혈액을 사용하는 절차를 시연하겠습니다. 표준 방법에 따라 lymphocyte separation medium을 사용하여 PBMC를 분리하십시오. 오염된 혈소판을 제거하기 위해 PBS로 PBMC 준비물을 세척하십시오.

적혈구 오염이 눈에 띄게 나타나는 경우, CK 용해 버퍼를 사용하여 적혈구를 용해하십시오. 그 후 PBS Resus로 두 번 더 세척합니다. 동종 항원 분석을 위해 PBMC를 1mL당 1,000만 PBMC 농도로 PBS에 현탁하십시오.

이전 단계에서 보여준 절차를 사용하여 기증자의 말초혈액에서 분리한 P BMCs로 시작합니다. 그 후 재현탁합니다. 기증자 세포를 1 mL당 120 million cells 농도로 PBS에 현탁하고, 단백질 분해를 방지하기 위해 1 µM의 PMSF를 첨가합니다.

이제 2 mm 프로브 소니케이터를 사용하여 1초 간격으로 7회 펄스를 주어 세포 현탁액을 초음파 처리합니다. 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포의 90% 이상이 파괴되었는지 확인합니다.

다음으로, 혼합물을 4°C에서 14,000 RPM으로 20분 동안 원심분리하십시오. 상층액을 safe lock 튜브로 조심스럽게 옮기고, 각 주입분당 단백질 농도를 표준 방법으로 측정하십시오. 10⁶개의 PBMC를 2 mL씩 7회분으로 분주하십시오.

Safe lock 튜브를 사용하여 원심분리로 세포를 펠렛화합니다. 먼저, 35 µL의 PBS에 PBMC 음성 대조군 현탁액을 준비합니다. 그 다음 양성 대조군을 위해 회상 항원인 tetanus toxoid와 diptheria toxoid를 25 µL 첨가하고, PBS를 사용하여 주입 부피를 35 µL로 맞춥니다.

공여체 특이적 반응을 평가하기 위한 실험 설계에 따라, 세포 펠렛을 10 µL의 공여체 항원과 25 µL의 PBS에 재현탁하여 총 부피를 35 µL로 맞춥니다. 실험적 공여체 항원 특이적 조절을 평가하려면, 10 µL의 공여체 항원과 25 µL의 리콜 TT DT 항원을 첨가하여 세포 펠렛을 35 µL로 재현탁합니다. isof fluorine으로 마우스를 마취시킨 후, 측정 부위의 일관성을 유지하기 위한 기준점을 제공하기 위해 스프링 로드 캘리퍼의 한쪽 가장자리가 발의 마지막 보행 패드에 닿도록 하여 발바닥 중앙에 배치하고, 게이지의 수치가 안정될 때까지 기다립니다.

발바닥 주사를 위해 기저 발바닥 두께를 기록하십시오. 바늘 끝이 발가락을 향하고 사면(bevel)이 위를 향하도록 주사기를 배치하십시오. 이제 각 세포 현탁액을 마우스의 뒷발바닥에 피하 주사하십시오.

첫째, 음성 대조군 준비물을 오른쪽 발 패드에 천천히 주입합니다. 다음으로, PBMC와 TT dt의 양성 대조군을 왼쪽 발 패드에 주입합니다. 이제 마우스를 케이지로 돌려보냅니다.

두 번째로, 오른쪽 발바닥에 PBMC와 allo 항원을 주입하고, 왼쪽 발바닥에는 PBMC, allo 항원 및 TT dt를 함께 주입합니다. 주입 후 18~24시간 사이에 누출이 없는지 확인하십시오. 각 마우스를 isof fluorine으로 마취시킨 후 발바닥 부종 측정을 반복합니다.

주사 후의 발 패드 두께에서 주사 전의 두께를 빼서 발 패드 부종 값을 구합니다. 그런 다음, 처리군에서 얻은 발 패드 부종 값에서 대조군 발 패드 부종 값을 빼서 항원 특이적 순 부종을 계산합니다. 양성 대조군 판독값이 회상 항원 TT DT에 대해 25 × 10⁻⁴ inches 이상의 양성 대조군 반응을 보이는지 확인하십시오.

테스트가 유효한 것으로 간주되려면 PBS에 대한 배경 반응이 필요합니다. 다음으로, 공여자 항원이 있을 때 재자극 반응의 억제 정도를 결정합니다. 이 실험은 신장 이식 수혜자의 공여자 항원 특이적 반응 및 조절 능력을 평가합니다.

이식 수혜자의 지연형 과민반응에는 조절성, 비조절성, 감작성의 세 가지 주요 패턴이 있습니다. 모든 환자는 회상 항원 tt의 양성 대조군에 강하게 반응했습니다. 환자 번호 62는 공여 항원에 대한 약한 반응과 공여 항원이 존재할 때 회상 항원 반응에 대한 뚜렷한 연관 억제가 특징인 조절성 패턴을 보여줍니다.

이는 장기 동종이식 내성과 연관이 있는 것으로 밝혀진 패턴입니다. 환자 48번은 비조절성 패턴을 보이며, 이는 공여자에 대한 반응은 약하지만 연관된 억제 반응은 나타나지 않는 특징이 있습니다. 이러한 패턴은 면역억제제를 복용하는 환자들에게서 빈번하게 관찰되었습니다.

환자 8번은 공여자 항원에 대한 높은 반응성과 연관된 억제 반응의 부재를 특징으로 하는 공여자 감작 패턴을 보입니다. 이러한 반응은 이식편 거부 반응과 관련이 있습니다. 임상 사례 연구에서는 관찰 시험에 참여한 대상자의 P BMC를 대상으로 공여자 특이적 간접 경로, T 작동 세포 및 T 조절 세포 반응을 분석하여 임상적 내성에서 공여자 특이적 조절의 역할을 평가하였습니다.

공여 항원에 대한 간접적인 T 세포 반응은 등록 그룹 전반에 걸쳐 뚜렷한 스펙트럼을 나타냅니다. 환자의 임상 상태가 내성 상태에서 만성 거부 상태로 진행됨에 따라 발바닥 부종이 증가합니다. 여기서 연결 억제 분석(linked suppression assay)은 T 조절 세포 반응의 항공여 간접 경로를 측정합니다.

이 데이터는 가장 내성이 강한 환자부터 중간 단계, 그리고 내성이 가장 낮은 만성 거부 반응 환자에 이르기까지 조절 반응이 감소함을 보여줍니다. 종합해 볼 때, trans vivo DTH 분석으로 측정된 면역 조절은 신장 동종이식편 수용의 중요한 기전인 것으로 보입니다.

유망한 분야 중 하나는 자가면역 모니터링에 TDTH 분석법을 적용하는 것입니다. 폐세기관지염 폐쇄성성 세기관지염(BOS) 증후군의 병리적 과정에서 5형 콜라겐의 역할에 관한 연구 결과, 콜라겐에 긍정적인 반응을 보인 폐 이식 수혜자의 pbmc에서 BOS 발생의 상대적 위험도가 가장 높게 나타났으며, 건강한 대조군이나 콜라겐에서는 관찰되지 않았습니다.

신장 이식 후 반응성을 보인 4명의 Good Pasture 증후군 환자들은 빈번하게 collagen five에 반응했습니다. TDTH 분석법은 암 환자의 pbmc가 종양 특이 항원에 반응하는지 테스트하는 데에도 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 전립선암 환자에게 PAP 특이적 T 조절 세포가 존재하면 PAP 항원 백신 접종에 대한 반응이 제한될 수 있습니다.

TRANSVAAL DTH 분석법은 이식, 암 및 자가면역질환 환자의 세포 매개 면역 반응을 평가하는 임상 응용 분야의 새로운 진단 검사입니다. 이 방법은 T 작동 세포의 회상 반응을 모니터링하는 데 유용할 뿐만 아니라, 작동 T 세포 또는 조절 T 세포를 검출하기 위해 특정 사이토카인 측정에 의존하지 않으므로 T 조절 반응을 검출하는 데에도 사용할 수 있어 가치가 있습니다. 또한 매우 유연하며 광범위하게 적용 가능합니다.