경쟁 손쥐 골수 이식 모델에서 기증자 세포 Engraftment를 확인하려면 수량 실시간 PCR을 사용하여

이 절차의 전반적인 목표는 경쟁력 있는 쥐 골수 이식 모델에서 기증자 세포 생착을 정량화하기 위한 PCR 기반 기술을 수행하는 것이며, 이는 먼저 남성 기증자 세포를 사용하여 암컷 수혜자 마우스에서 골수 이식을 수행함으로써 달성됩니다. 다음으로, 서로 다른 시점에서 수용 마우스에서 말초 혈액을 수집하고 게놈 DNA를 분리합니다. 샘플은 표준 곡선에 대해 준비됩니다.

마지막으로, Real-Time PCR은 표준 검체 및 테스트 검체를 사용하여 수행됩니다. 궁극적으로, 남성 대 여성 DNA의 알려진 비율이 있는 표준 곡선에 대한 계산을 통해 여성 수혜자 마우스에서 남성 기증자 유래 세포의 생착을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 유세포 분석 기반 방법과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 장점은 더 민감하고 경제적이며 샘플을 장기간 보관할 수 있다는 것입니다.

가장 중요한 것은, 우리의 기술은 가장 끈과 무관하며 기증자 세포와 수용 세포를 구별하기 위해 잘 정의 된 세포 표면 마커와 같은 마우스의 게놈 배경에 사용할 수 있습니다 FVB nj를 안락사 한 후, 층류 후드 아래의 수컷 기증자와 암컷 마우스는 작은 가위와 집게를 사용하여 대퇴골과 경골 뼈를 해부하고 6 밀리리터의 얼음 냉기가 들어있는 60mm 조직 배양 접시에 넣습니다 5% 열이 비활성화된 RPMI 1640. FBS는 킴 와이프를 사용하여 근육 및 기타 조직을 제거하고 접시에 있는 각 뼈 축의 양쪽 끝을 잘라냅니다. 그런 다음 뼈 끝을 RPMI 1640과 5% 열 비활성화 FBS로 채워진 3cc 주사기에 부착된 23 게이지 바늘에 연결하고 골수를 씻어냅니다.

동일한 바늘을 사용하여 반복적인 흡인으로 골수 조직을 분해합니다. 세포 현탁액을 15 밀리리터 원심 분리기 관으로 옮기고 400 G.After에 5 분 동안 그것을 회전시키십시오 supernat를 제거한 후에, 실내 온도, 적혈구 용해, 완충액의 1 밀리리터에 있는 세포를 resuspend하고, 5 분 동안 실내 온도에 배양하십시오 5% 열을 비활성화한 FBS를 가진 RPMI 1640의 5 밀리리터에 10 밀리리터를 추가하기 전에 세포 스트레이너를 통해서 세포를 통과하고 새로운으로 교류를 처음부터 끝까지 모으십시오 관. 400G에서 5분 동안 세포를 회전시키고 상층액을 제거한 후, 펠릿에는 적혈구가 없어야 하며, 부드럽게 와류를 일으킨 후 FBS가 5% 열로 비활성화된 10밀리리터의 RPMI 1640에 재현탁된 적혈구를 완전히 제거하고 혈구 분석기에 작은 부분 표본을 추가하고 세포를 계수합니다.

골수 이식을 위해 경쟁사 여성 세포와 혼합하는 데 필요한 세포의 양을 5:2의 비율로 계산합니다. 주사를 위한 세포를 준비하기 위한 마지막 단계로, 골수 이식 4-6시간 전에 공여자와 경쟁자 세포를 혼합하고, PBS로 세포를 펠렛화하고, PBS에 재현탁합니다. 최종 농도는 10-밀리리터 기증자 세포의 경우 10-6번째, 경쟁 세포의 경우 밀리리터당 6배의 최종 농도입니다. 암컷 수혜자 마우스에 세슘 1 37 감마선을 11 grays의 단일 선량으로 조사합니다.

방사선 조사된 암컷 마우스를 마우스 억제기에 넣고 꼬리 정맥을 통해 혼합된 기증자 및 경쟁 세포를 총 0.1 밀리리터의 부피로 주입하여 각 마우스가 5 곱 10 곱 다섯 번째 기여자 세포에, 두 곱 10 곱 다섯 번째 경쟁 골수 세포를 받아 혈액 샘플을 채취합니다. 마취 후 마우스는 후안와 출혈을 통해 약 50마이크로리터의 혈액을 EDTA 코팅 튜브에 수집합니다. 또한 연령이 일치하는 수컷 및 암컷 마우스에서 샘플을 수집합니다.

다음으로 대상 마우스와 마우스에서 게놈 DNA를 분리합니다. 표준 곡선의 경우, 각 혈액 샘플에 약 200마이크로리터의 실온 RBC 용해 완충액을 추가하고 5분 동안 배양합니다. PBS 1ml를 넣고 스핀다운하여 용해된 적혈구를 대부분 제거합니다.

그런 다음 혈액 DNA 추출 키트를 사용하여 엘루시안 완충액을 섭씨 37도로 예열 전 DNA를 분리합니다. 수율을 높이려면 각 샘플의 DNA 농도를 측정하십시오. 1.8에서 2.0 사이의 OD 2 60 대 2 80 비율을 가진 사람들이 추가 분석을 위해 사용됩니다.

표준 곡선을 설정하려면 남성과 여성의 DNA를 마이크로리터당 4나노그램의 농도로 희석하고 이 지침에 따라 DNA 혼합물을 준비합니다. Cyber green super mix 시약과 여기에 표시된 프라이머 및 게놈 DNA를 혼합하여 PCR 반응 플레이트를 설정합니다. 각 20마이크로리터 반응에는 각 프라이머의 400나노 몰과 5마이크로리터의 혈액 세포 게놈 DNA가 3회씩 포함됩니다.

텍스트 프로토콜에 있는 조건에 따라 PCR을 수행하고 주기 임계값 또는 CT 값을 얻습니다. 델타 CT를 계산하고, 수량 CT를 ZY의 거듭제곱에 곱한 값, CT를 BCL 2의 거듭제곱에 곱하고, ZY 1의 거듭제곱 수준 또는 2를 빼기 델타 CT의 거듭제곱에 곱한 값을 계산하고, 표시된 선형 회귀 피팅과 혼합물에서 알려진 퍼센트 남성 DNA에 대한 델타 CT 값의 3배 2의 평균을 플로팅하여 표준 곡선을 생성합니다. 다음은 남성 DNA의 백분율에 대한 델타 CT의 거듭제곱에 대한 평균 값 2로 표시된 표준 곡선의 예입니다.

이 플롯에는 각각 섭씨 78.5도 및 88.5도에 국한된 BCL 2 및 ZFY 1 앰플리콘의 특정 용융 온도가 포함됩니다. BCL 2는 각 PCR 반응에서 적재된 DNA의 총량을 정상화하기 위한 참조 유전자로 사용됩니다. 각 표준 샘플에 대한 BCL 두 개의 증폭 곡선은 남성 DNA 농도와 무관하게 서로 병합되어 동일한 양의 로드된 DNA를 나타냅니다.

그러나, PIM TKO 마우스의 조혈 줄기세포에서 샘플 내 수컷 DNA의 양이 증가함에 따라 ZFY one 증폭 곡선이 왼쪽으로 이동함에 따라 치명적으로 방사선 조사된 마우스를 재구성하는 데 결함이 있으며, 예상대로 PIM TKO 세포를 이식한 수용 마우스는 야생형 세포를 이식한 마우스에 비해 남성 세포의 비율이 훨씬 낮았습니다. 이 방법을 검증하기 위해 이식된 암컷 마우스에서 수컷 기증자 세포 생착을 테스트했으며, 이식 후 다른 시점에 야생형의 골수 세포와 PIM 트리플 녹아웃 또는 TKO 마우스(모두 6주에 말초 혈액, 16주에 골수 샘플)를 받았습니다. 이 비디오를 본 후 분석되었습니다.

경쟁력 있는 해양 골수 이식 모델에서 기증자 세포 생착을 정량화하기 위해 PCR 기반 방법을 사용하는 방법을 잘 이해하고 있어야 합니다.