골수 이식으로 마우스 대장염에서 면역 및 비 면역 세포에서 유전자 발현의 기능 역할을 차별화

이 영상에서 시연하는 실험의 전반적인 목적은 항균 펩타이드 lyin이 마우스의 덱스트란 황산염 유도 결장염 완화에 역할을 하는지 평가하는 것입니다. 이를 위해 방사선을 조사한 야생형 및 녹아웃 마우스에 야생형 마우스의 골수를 주입하고, 방사선을 조사한 야생형 마우스에 녹아웃 마우스의 골수를 주입합니다. 이식된 골수는 공여자의 유전자형에 따른 새로운 혈구 세포를 수혜자 체내에서 생성하게 됩니다.

그 후 수용 쥐에게 덱스트란 황산염을 투여하여 4주 뒤에 결장염을 유도합니다. 이식 성공 여부는 유세포 분석법으로 검증하고, 결장 조직 손상 정도는 조직학적으로 평가합니다. 분석 결과, 결손 쥐에게 야생형 골수를 이식했을 때 결장염이 완화되는 것으로 나타났습니다.

반대로, 결손 골수를 야생형 마우스에 이식하면 결장염이 악화됩니다. 이 방법은 염증 또는 감염 시 골수 유래 세포 또는 비골수 유래 세포의 유전자 발현을 결정하는 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 야생형 마우스와 결손 마우스를 추적할 수 있도록 이 실험에는 C 57, black six, 야생형 및 C 유도 결손 마우스가 권장됩니다.

골수 이식 후의 공여자 세포. 야생형 마우스는 CD 45.1 마우스로, 녹아웃 마우스는 CD 45.2 마우스로 표기합니다. 여기에 제시된 도표는 실험 설계를 설명하며, 각 그룹당 5마리의 공여자 마우스와 10마리의 수혜자 마우스가 배정됩니다.

그룹 A와 B의 경우, 야생형 마우스에서 결손 마우스로 골수를 이식합니다. 그룹 A에서는 결장염을 유도하고, 그룹 B에서는 유도하지 않습니다. 그룹 C와 D의 경우, 결손 마우스에서 야생형 마우스로 골수를 이식하며, 그룹 C에서만 결장염을 유도합니다. 그룹 E와 F의 경우, 야생형에서 야생형으로 이식하며, 그룹 G와 H의 경우, 결손 마우스에서 결손 마우스로 이식합니다. 조사된 마우스에 이식할 공여 골수를 준비하기 위해, 우선 생물안전 작업대 내에서 희생된 마우스의 뼈에서 골수를 추출합니다.

멸균된 해부 도구를 사용하여 상완골, 대퇴골, 경골 및 비골을 부착된 근육과 인대로부터 분리하여 노출시킨 후, 이를 페트리 접시에 옮깁니다. 뼈의 양쪽 끝을 절단하여 적색 골수를 드러나게 합니다. 그런 다음 포셉으로 뼈 중 하나를 잡습니다.

3 mL 주사기와 25G 바늘을 사용하여 차가운 PBS로 적색 골수를 다른 페트리 접시로 씻어내십시오. 그다지 골수의 반대쪽 끝에서도 씻어내어 더 많은 골수 세포를 얻으십시오. 각 뼈에 대해 이 과정을 반복하십시오.

야생형 및 녹아웃 마우스의 골수를 각각 따로 모읍니다. 18게이지 0.5인치 바늘이 장착된 6mL 주사기를 사용하여 적골수 플러그를 반복적으로 흡인 및 배출함으로써 분쇄합니다. 그 후, 세롤로지컬 피펫을 사용하여 수집된 골수를 50mL 원추형 튜브로 옮깁니다.

모든 골수를 옮긴 후, 4°C에서 740 G로 5분 동안 원심 분리합니다. 원심 분리가 끝나면 상층액을 제거하고 5~10초 동안 볼텍싱하여 펠릿을 재부유시킵니다. 펠릿에 공여 마우스 한 마리당 5 mL의 XRBC 용해 버퍼를 첨가하고 다시 5초 동안 볼텍싱한 후, 실온에서 정확히 3분 동안 배양합니다.

3분 후, 각 튜브에 차가운 PBS 20 milliliters를 첨가하고 도치 혼합하여 용해를 중단시킵니다. 그런 다음 내용물을 40 micron 세포 스트레이너를 통해 새로운 50 milliliter 원추형 튜브에 붓습니다. 원래 튜브를 PBS 5 milliliters로 헹구고 해당 용액을 세포 스트레이너로 옮깁니다.

원뿔형 튜브에 계속해서 유출액을 수집합니다. 그 다음 PBS를 사용하여 부피를 50 milliliters까지 맞추고 전도 혼합하여 섞어줍니다. 이어서 헤모사이토미터를 이용한 트라이판 블루 배제법으로 생존 세포 수를 측정합니다.

세포 수를 결정한 후, 골수 세포를 4°C에서 913 ×g로 5분간 원심 분리합니다. 원심 분리가 끝나면 총 세포 수에 따라 상층액을 제거합니다. 펠렛을 1 × 10⁸ cells/mL의 농도로 PBS에 재현탁합니다.

이제 골수 세포를 조사된 수용 마우스로 이식할 준비가 되었습니다. 본 실험을 위한 수용 야생형 및 녹아웃 마우스는 동봉된 문서에 기술된 대로 1000 rad의 방사선을 조사받았습니다. 마우스는 무균 시설에서 번식 및 사육되었으며, 조사 후 4~24시간 뒤에 공여 골수를 주입하기 위해 가온 램프 아래 가온 패드에서 수용 마우스를 가온합니다. 수용 마우스를 보정기에 넣고, 주사 부위를 소독하고 국소 혈관 확장을 촉진하여 주사를 용이하게 하기 위해 꼬리를 70% ethanol로 닦아냅니다.

28.5게이지 바늘이 달린 인슐린 주사기를 사용하여, 1×10⁷개의 세포를 1~200 µL의 부피로 각 마우스의 꼬리 정맥에 주입합니다. 주입 후 처음 4주 동안은 주입된 마우스를 최대 3마리의 다른 주입된 마우스와 함께 케이지에 둡니다. 주입된 수용 마우스는 항생제 sulfa trim이 포함된 물이 제공되는 오토클레이브 케이지에서 사육합니다.

이를 통해 동물이 면역력을 회복할 시간을 갖도록 하며, 위생 유지를 위해 4일마다 케이지를 교체하고 항생제가 처리된 물과 사료를 제공합니다. 방사선 조사 및 골수 이식 4주 후, 항생제가 없는 일반 물로 교체하고 2주 더 유지하여 정상적인 장내 미생물군을 회복시킵니다. 골수 주입 6주 후, 대장염을 유도하기 위해 초기 체중을 측정합니다.

염증성 장질환(colitis) 실험군 쥐의 음용수에 5% dextran sulfate를 공급합니다. 5일 후, 4마리 쥐의 말초혈을 헤파린 코팅 vacutainer 튜브에 모아 얼음 위에 둡니다. 그다음 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 혈액 300 µL와 세포 염색 버퍼 300 µL를 혼합하고, 이를 1번부터 5번까지 표시된 5개의 유세포 분석용 시험관에 각각 100 µL씩 나누어 얼음 위에 둡니다.

마우스를 희생시킨 후, 체중을 다시 측정하여 변화량을 계산합니다. 결장 조직을 적출하여 H&E 염색을 위해 포르말린에 고정합니다. 그런 다음 이전과 동일한 방법으로 골수 세포를 얻습니다.

재현탁된 골수를 1번부터 5번까지 표시된 5개의 마이크로 원심분리 튜브에 각각 100 milliliters씩 나누어 넣습니다. 유세포 분석을 위해, 동봉된 문서에 기술된 대로 각 튜브에 해당하는 항체 혼합물을 암실에서 준비합니다. 1번으로 표시된 혈액 및 골수 시료는 대조군으로 사용하며 염색하지 않습니다. 2번으로 표시된 혈액 및 골수 시료는 fitzy isotype control PE isotype control 및 CD 16/32 차단 용액으로 염색합니다.

이러한 아이소타입 대조군은 1차 항체가 샘플에 특이적으로 결합하는지 확인하는 데 사용됩니다. 3번으로 표시된 라벨의 샘플은 FZ CD 45.1 및 CD 16/32로 염색됩니다. 4번으로 표시된 블로킹 솔루션 샘플은 CD 45.2 및 CD 16/32로 염색됩니다.

블로킹 용액. 단일 색상 표지는 혈액 또는 골수 내 공여 세포나 수용 세포의 존재 여부를 확인할 수 있게 합니다. 5번으로 표시된 샘플은 CD 45.1, CD 45.2 및 CD 16/32에 대해 염색될 것입니다.

여기서 이중 색상 표시는 혈액 또는 골수 내 공여자 세포와 수혜자 세포의 상대적 비율을 보여줍니다. 각 샘플 튜브에 항체 혼합물 2와 5를 5 µL씩 첨가하십시오. 그런 다음 각 샘플 튜브에 항체 혼합물 3과 4를 3 µL씩 첨가하십시오.

모든 튜브를 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 각 튜브에 XRBC lysis buffer 2 mL를 첨가합니다. 그런 다음 샘플을 어두운 상태로 얼음 위에서 15분 더 배양합니다.

세포를 350 ×g에서 4 °C로 5분간 원심분리합니다. 원심분리 후, 상청액을 제거하고 펠렛을 500 µL의 세포 염색 버퍼로 암실에서 재현탁합니다. 그 다음 짧게 볼텍싱합니다.

다음으로, 면역 염색된 혈액 및 골수 샘플에 대해 유세포 분석을 수행합니다. 야생형 CD 45.1은 FZ로, 녹아웃 CD 45.2는 PE로 지정하십시오. Flo Joe 소프트웨어를 사용하여 유세포 분석 결과를 분석합니다.

혈액과 골수에서 공여체 유전형이 우성 유전형인지 결정하기 위해 fit E 대비 PE 비율 또는 PE 대비 fit e 비율을 계산합니다. 이 이미지는 정상 조직학적 소견을 보이는 결장과 DSS 결장염이 있는 결장의 h and e 샘플 이미지를 보여줍니다. 조직학 이미지는 점막 조직 손상 및 점막 및 점막하 조직으로의 호중구 침윤 정도를 기준으로 점수를 매깁니다.

따라서, lyin이 대장염 예방에 역할을 하는지 테스트하기 위해 조직학적 점수가 높을수록 대장염이 더 심각함을 나타냅니다. 이 비디오에서 설명한 대로 야생형 및 knockout 마우스 간에 골수를 이식하였습니다. 그 후, 여기에서 보여주는 바와 같이 조직학적 평가 및 점수 산정을 수행하였습니다.

방사선을 조사한 야생형 생쥐에 녹아웃 생쥐의 골수를 도입했을 때 조직학적 점수가 유의하게 증가했습니다. 반대로, 녹아웃 생쥐에 야생형 골수를 도입했을 때는 점수가 유의하게 감소했습니다. 이러한 데이터는 골수 유래 세포의 내인성 C가 항염증 효과를 가지며 대장염을 완화시킨다는 것을 나타내며, 이 생쥐들에서 이식이 성공적으로 이루어졌음을 입증합니다.

이식 후 마우스의 골수와 혈액에 대해 유세포 분석도 수행하였습니다. 여기에서 보는 바와 같이, 야생형 골수는 Fitz CD 45.1에는 강하게 염색되지만 PE CD 45.2에는 염색되지 않으며, 녹아웃 골수는 PE에는 강하게 염색되지만 Fitz에는 염색되지 않습니다. 그러나 이식 후, 녹아웃 골수를 이식받은 야생형 마우스의 골수와 혈액 모두 Fitz가 아닌 PE에 강하게 염색되었으며, 이는 염색된 세포의 주된 집단이 공여체 유래임을 나타냅니다.

마찬가지로, 야생형 골수를 이식받은 knockout 마우스의 골수와 혈액에서는 fitzy에 대해 강한 염색 반응이 나타났으나 pe에는 나타나지 않았으며, 이는 염색된 주요 세포 집단이 공여자 유래임을 다시 한번 확인시켜 줍니다. 이 영상을 시청한 후에는 골수 이식 실험을 수행할 수 있으며, 골수 유래 세포를 통해 대장염을 조절할 수 있게 될 것입니다.