SynVivo 합성 미세 혈관의 네트워크를 사용하여 전단 접착지도의 생성

다음 실험의 전반적인 목표는 합성 미세혈관 네트워크를 사용한 단일 실험에서 세포 입자 접착의 순전한 접착 맵을 얻는 것입니다. 이것은 먼저 미세유체 장치를 관심 단백질(이 경우 아바돈)로 코팅함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 비오틴화된 입자가 생리적 전단 속도로 장치에 주입되며, 이는 국소 전단 속도에 따라 차등 패턴으로 avadon 코팅 장치에 결합합니다.

다음으로, 네트워크에서 순전히 속도 값의 계산적으로 생성된 데이터베이스를 사용하여 입자의 순전한 접착 맵을 생성하기 위해 결합된 입자의 수를 계산합니다. 결과는 단일 실험에서 순전한 접착 맵을 얻을 수 있어 기존의 병렬 플레이트 플로우 챔버에 비해 시간과 시약을 크게 절약할 수 있음을 보여줍니다. 선형 흐름 채널과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 단일 실험에서 공유 지도를 생성할 수 있어 비용과 시간을 크게 절약할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 약물 전달 매체가 원하는 표적과 결합하는 능력과 같은 약물 전달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리는 세포 특정 병변을 이해하기 위해 패들 플레이트 흐름 챔버를 사용할 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다. 그러나 유체 조건에서 이 분석의 초점은 입자 및 세포 부착에 대한 기본적인 통찰력을 제공하는 것입니다.

syn vivo 플랫폼은 암 및 CNS 전달, 감염 및 염증, 혈전증, 미세순환 기능 장애와 같은 다양한 다른 시스템에 적용할 수 있습니다. 마이크로 유체 장치 단계는 배우기 어렵고 작은 시료 부피에 익숙해지기 때문에 이 방법의 시각적 시연은 매우 중요하며, 기포 형성을 방지하기 위한 모범 사례가 시각적으로 더 잘 전달되기 때문입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 우리 연구실의 연구 과학자인 Ashley Smith입니다.

SynVivo SMN 미세유체 장치는 두 세트의 병렬 포트로 구성되며, 하나는 표면 코팅, 모이어티 및/또는 시트용 셀로 흐르기 위한 포트이고 다른 하나는 분석을 실행하기 위한 포트입니다. 시작하려면 멸균 탈이온수가 들어 있는 페트리 접시에 장치를 완전히 담그고 접시를 진공 청소기에 넣습니다. 건조는 장치의 채널에서 모든 공기가 제거될 때까지 건조제가 작동하도록 합니다.

물에서 장치를 제거하기 전에 약 15분이 소요됩니다. 가는 점 집게를 사용하여 물로 프라이밍된 타이곤 튜브를 장치의 각 포트에 놓습니다. 튜브의 길이는 약 1인치여야 합니다.

이제 피펫이나 주사기를 사용하여 장치에서 장치를 제거할 수 있습니다. 한 흡입구 튜브의 바닥 주위에 물 한 방울을 놓습니다. 튜브를 조심스럽게 제거합니다.

물방울은 공기가 장치에 들어가는 것을 방지합니다. 다음으로, 밀리리터당 20마이크로그램의 농도로 아바돈이 장전된 1밀리리터 주사기를 준비합니다. 주사기를 24게이지 스테인리스강 바늘 및 튜브 Clamp 입구 포트는 턱 cl과 함께 사용되지 않습니다.amp.

튜브를 장치의 입구 포트에 삽입합니다. 10분 동안 분당 1마이크로리터의 유속으로 아바돈을 주입하여 장치의 완전한 관류를 허용합니다. 흐름 시간이 끝날 때.

턱 클램프로 모든 튜브를 고정하고 밤새 장치를 4도로 놓습니다. 장치가 실온에 오도록 합니다. 그런 다음 전동 스테이지와 고성능 카메라가 장착된 도립 형광 현미경에 장치를 놓습니다.

밀리리터당 500만 입자 농도의 2미크론 비오틴화 입자 용액을 인산염 완충액 식염수 또는 PBS에 준비합니다. 입자를 1ml 주사기에 넣습니다. PBS의 두 번째 1ml 주사기를 준비합니다.

각 주사기를 주사기 펌프에 로드한 다음 피펫터 주사기를 사용하여 니들과 튜브에 연결하기만 하면 됩니다. 입구 포트 튜브의 바닥 주위에 물 한 방울을 놓고 장치를 코팅하는 데 사용되는 튜브를 조심스럽게 제거합니다. 비오틴화된 입자와 PBS를 위한 튜브를 각 주입구 포트에 조심스럽게 삽입합니다.

그런 다음 분당 2.5마이크로리터의 유속으로 비오틴화된 입자를 주입하기 시작합니다. 입자의 첫 번째 징후에서 현미경의 입구 포트를 모니터링합니다. 타이머를 시작하고 3분 동안 흐름을 계속합니다.

3분이 지나면 비오틴화된 입자의 흐름을 멈추는 동시에 분당 2.5마이크로리터의 유속으로 PBS의 흐름을 시작합니다. PBS가 장치에 3분 동안 흐르도록 하여 결합되지 않은 입자를 씻어냅니다. 수집을 시작하려면 이미징 소프트웨어의 대형 이미지 스캔 기능을 사용하여 전체 장치의 이미지를 획득한 다음, 순차적으로 장치의 분기점에 번호를 매기고 채널 직경의 두 배인 원형 관심 영역을 생성합니다.

이 경우 채널 직경이 100미크론이므로 관심 영역 직경을 200미크론으로 설정합니다. 이미징 소프트웨어의 자동 계수 기능을 사용하여 각 관심 영역의 입자 수를 스프레드시트로 내보낼 수 있습니다. 마찬가지로 자동화된 계정 기능을 사용하여 전체 장치의 파티클 수를 내보냅니다.

CFD 시뮬레이션이 실행되고 결과는 추가 분석을 위해 데이터베이스에 저장됩니다. 결과에 포함된 정보에는 벽 전단 속도, 속도, 입자 플럭스 및 장치 준수 정도가 포함됩니다. 여기에 있는 정보는 정의된 입자 농도 입력이 주어지면 각 관심 영역에 부착되는 입자의 수를 결정하는 데 사용됩니다.

전단 접착 맵을 생성하려면 최종 단계로 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 접착 비율을 계산합니다. 네트워크의 각 분기점에서의 순전율(sheer rate)과 접착율 값을 사용하여 순전히 접착력 맵을 플로팅합니다. 이 이미지는 두 미크론 비오틴화 입자의 결합에 따른 일반적인 avidan coated syn vivo SMN 장치를 보여줍니다.

입자는 네트워크의 분기점 근처에 우선적으로 부착됩니다. syn vivo SMN 네트워크에서 번호가 매겨진 분기점은 여기에서 볼 수 있습니다. 이 이미지는 장치의 CFD 모형에 의해 생성된 샘플 벽 전단 맵입니다.

전단 속도는 생체 내 미세 혈관 구조에서 관찰된 바와 같이 250 역초에서 15 역초까지 범위에서 장치에서 다양합니다. 이러한 다양한 전단 속도는 각 유속에 대해 일정한 전단 속도를 제공하기 때문에 선형 미세유체 채널에서 동시에 얻을 수 없습니다. 여기에 표시된 네트워크의 각 분기점에서 전단 속도 값에 대한 플롯은 전단 속도 패턴이 복잡하고 선형 흐름 채널과 달리 간단한 해석 관계로 얻을 수 없음을 보여줍니다.

또한, 동일한 순식 bin에 속하는 여러 분기가 네트워크에 존재합니다. 표시된 데이터의 통계적 신뢰도를 높입니다. 다음은 실험 네트워크의 분기 및 분기점에서 입자 플럭스를 계산하는 데 사용되는 네트워크의 입자 플럭스에 대한 CFD 분석의 샘플 결과입니다.

단일 syn vivo SMN 실험에서 계산된 순전히 접착 맵은 선형 채널 실험에서 얻은 순전한 접착 맵에서 관찰된 것과 같은 역 관계를 따릅니다. 그러나 SynVivo 분석을 사용하면 단일 실험으로 이 순전한 맵을 생성할 수 있는 반면, 선형 채널에서 여러 실험 실행을 획득할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 단일 실험에서 공유 접착력을 생성하기 위해 SynVivo SMN 장치를 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 실험을 수행할 때 개발 후 SynVivo SMN 미세유체 장치에 기포가 발생하지 않도록 하는 것이 중요합니다. 이 기술은 염증 분야의 연구자들이 단일 실험에서 다양한 순전히 속도로 백혈구 내피 상호 작용을 연구할 수 있는 길을 열었습니다. 차세대 장치에서 연구원들은 단일 분석에서 백혈구 롤링 접착 및 이동을 연구할 수 있으며, 이는 현재 불가능합니다.

이 절차에 따라 약물, 약물 전달 매개체 및 세포의 부착을 조사하는 다른 방법을 수행하여 세포 세포에 대한 흐름의 생리학적 효과, 세포 약물 및 약물 운반체 접착과 같은 질문을 조사할 수 있습니다.