사용하여 전통과 소설 오버레이 시스템 : 플라크 분석 실험을 통해 바이러스 농도 결정

이 절차의 전반적인 목적은 세포 배양에서 개별 플라크(plaque)를 계수하여 감염성 바이러스 입자를 정량함으로써 바이러스 농도를 결정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 세포를 플레이팅하여 감염을 위한 합류 단층(confluent monolayer)을 형성합니다. 두 번째 단계는 정량하고자 하는 미지의 바이러스 샘플을 단계적으로 희석하는 것입니다. 다음으로, 단계 희석된 바이러스 스톡을 사용하여 합류 단층을 감염시킨 후, 고정용 오버레이(overlay)를 도포합니다. 마지막 단계는 해당 바이러스에 적합한 배양 시간이 지난 후 플라크를 고정하고 염색하여 개별 플라크를 계수하는 것입니다. 결과적으로, 플라크 분석법은 다양한 방식으로 활용 및 수정되어 미지의 바이러스 샘플의 바이러스 역가(viral titer)를 결정하는 데 사용될 수 있습니다.

반고체 오버레이(semi-solid overlay)와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 고처리량 및 전통적인 응용 분야 모두에서 적용과 제거가 훨씬 더 간단하다는 것입니다. 또한, 시약의 가열이 필요하지 않습니다. 96-웰 포맷의 액체 오버레이 사용을 통해 새로운 치료 화합물을 신속하게 스크리닝할 수 있으므로, 이 기술의 영향은 다양한 용해성 바이러스 연구로 확장될 수 있으며, 이는 전통적인 플라크 분석(plaque assay)을 수행하는 데 소요되는 긴 실험실 작업 시간을 크게 단축할 수 있습니다.

분석 전날, 감염 당일에 90~100%의 합류도(confluency)에 도달할 수 있도록 해당 바이러스에 적합한 세포를 플레이트에 분주합니다. 표준 용액 또한 분석 전날 준비할 수 있습니다. 먼저 36% 표준 포름알데히드 5.56밀리리터와 증류수 14.44밀리리터를 혼합하여 증류수에 10% 포름알데히드 고정액을 준비합니다. 그런 다음 20% 에탄올에 1% 크리스탈 바이올렛을 녹인 후 증류수로 희석하여 크리스탈 바이올렛 염색액을 준비합니다. 다음으로, 멸균 조건 하에서 사용하는 세포 유형에 적합한 2x 플라크 배지를 준비합니다. 시약 중 멸균되지 않은 것이 있다면 0.2마이크론 필터로 용액을 여과합니다. 플라크 분석용 액체 오버레이를 준비하려면, 교반기로 빠르게 혼합 중인 97.6밀리리터의 증류수가 담긴 플라스크에 Avicel 2.4그램을 넣습니다. 교반기로 섞기 어려울 정도로 점도가 높아질 때까지 상온에서 용액을 혼합합니다. 이 시점에서 플라스크를 플라스크 쉐이커로 옮겨 30분 동안 강하게 진탕하여 균일하게 균질화합니다. 마지막으로 121°C, 14 PSI 조건에서 30분 동안 용액을 오토클레이브합니다.

프로그램이 종료되면 밀봉하여 실온에 보관하십시오. 아가로스 오버레이의 경우, 증류수에 0.6% 아가로스 스톡 용액을 준비하고, 스터 바(stir bar)로 섞은 후 오토클레이브하여 용해시킵니다. 카르복시메틸셀룰로오스 오버레이의 경우, 증류수에 2% 카르복시메틸셀룰로오스 용액을 준비하여 섞습니다. 그 후 이전과 동일하게 오토클레이브합니다.

세포 도말 다음 날, 분석을 시작하기 전에 도립 현미경을 사용하여 세포의 합류도와 생존력을 확인하십시오. 세포가 표준적인 세포 형태를 나타내고 합류도가 약 90%인지 확인하십시오.

감염된 시료를 세포 성장 배지에서 10배 연속 희석하며, 해당 바이러스의 예상 타이터(titer)에 따라 필요한 희석 횟수를 조절합니다. 또한, 세포 생존력을 독립적으로 확인하고 플라크(plaque) 식별을 돕기 위해 비감염 대조군 시료를 준비합니다. 단일층(monolayer)이 손상되지 않도록 주의하며, 비감염 대조군과 연속 희석액을 플레이트의 웰(well)에 피펫으로 분주합니다.

단층 세포와의 바이러스 접촉을 최대화하기 위해 부피를 가능한 한 낮게 유지하면서도, 세포를 충분히 덮을 수 있는 양의 접종액을 사용하십시오. 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에 넣고 45분에서 1시간 동안 세포를 감염시킵니다. 20분마다 플레이트를 부드럽게 흔들어 접종액이 고르게 도포되도록 하고 세포 단층이 마르는 것을 방지하십시오.

감염 과정 동안, 액체 오버레이용 작업 용액을 준비합니다. 가온된 플라크 배지와 실온의 1.2~2.4% Stock Avicel을 1:1 비율로 혼합하여 0.6~1.2% Avicel 오버레이 배지 작업 용액을 만듭니다. 아가로스 또는 CMC 오버레이의 경우, 가온된 플라크 배지와 가열된 0.6% 아가로스 또는 2% CMC 스톡 용액을 1:1 비율로 혼합합니다. 그 다음, 온도 평형을 맞추기 위해 56 °C 항온수조에서 30분 동안 둡니다. 세포 사멸과 바이러스 타이터 감소를 방지하기 위해 용액이 따뜻하지만 만졌을 때 뜨겁지 않은 상태인지 확인하십시오. 감염 후, 감염된 단층 세포에 오버레이를 적용합니다. 오버레이를 추가한 후, 분석하려는 바이러스에 따라 37 °C, 5% CO2 조건에서 2~14일 동안 플레이트를 배양합니다.

액체 오버레이로 세포를 고정하려면 Avicel 오버레이를 따라내거나 흡입한 후, 10% formaldehyde 용액을 웰에 피펫으로 넣고 상온에서 30분부터 하룻밤까지 고정하십시오. agarose 또는 CMC의 경우, formaldehyde 용액을 오버레이에 직접 첨가하여 상온에서 1시간부터 하룻밤까지 두십시오. 고정 후 formaldehyde를 버리고, spatula를 사용하여 agarose 반고체 플러그를 수동으로 제거하십시오.

염색 전, 잔류 오버레이 고정액을 제거하기 위해 Avicel 세포 플라크를 물로 헹굽니다.

염색을 위해 세포를 최소량의 crystal violet 용액으로 약 15분 동안 덮어줍니다. 균일하게 덮이도록 필요한 경우 플레이트를 흔들어 줍니다. 물로 crystal violet 염색약을 조심스럽게 씻어냅니다. 고정, 염색 및 건조가 완료되면, 향후 분석을 위해 플라크를 무기한 보관합니다. 각 웰의 플라크 수를 세되, 플라크 수가 5개 미만이거나 100개를 초과하는 웰은 제외합니다. 동일한 희석 배수의 기술적 반복 실험(technical replicates)에 대해서는 평균값을 구합니다. 플라크의 크기와 형태를 기록합니다. 특정 희석 배수의 평균 플라크 수와 총 희석 배수의 역수를 곱하여 스톡 샘플의 바이러스 역가를 결정합니다.

이 이미지는 12-웰 플레이트를 이용한 Rift Valley fever virus 플라크 오버레이 비교 결과를 보여줍니다. Vero 세포를 12-웰 플레이트에 2.5 × 10⁵ cells로 분주하고, 동일하게 연속 희석된 MP 12 시작 시료를 사용하여 200 µL로 감염시켰습니다. 감염 후, 오버레이를 직접 비교하기 위해 0.3% agarose, 0.6% Avicel 또는 1% CMC 오버레이를 1.5 mL씩 도포하였습니다. 이 히스토그램은 세 가지 오버레이 모두에 대한 플라크 수 측정 및 타이터링 결과를 보여줍니다. 여기서는 12-웰 플레이트를 이용한 VEEV 플라크 오버레이 비교 결과가 제시되어 있습니다. Vero 세포를 이전과 동일하게 분주하고, 동일하게 연속 희석된 VEEV-TC 83 백신 균주 시작 시료를 사용하여 200 µL의 부피로 감염시켰으며, 감염 후 이전과 동일하게 0.3% agarose, 0.6% Avicel 세포 또는 1% CMC 오버레이를 1.5 mL씩 도포하였습니다.

다시 한번, 히스토그램은 세 가지 오버레이 모두에 대한 플라크 수 측정 및 역가 측정 결과를 보여줍니다. 이 이미지는 고처리량 플라크 오버레이의 예를 보여줍니다. 웰당 3 x 10⁴개의 Vero 세포가 도말된 96웰 플레이트에, 동일하게 연속 희석된 Rift Valley fever virus MP 12 시작 샘플의 접종물 50 µL를 사용하여 1시간 동안 4반복으로 감염시켰습니다. 오버레이의 경우, 고처리량 방식으로 액체 오버레이를 사용하는 것의 타당성과 재현성을 결정하기 위해 0.6% 및 1.2% 최종 농도의 Avicel 세포를 시험하였습니다. 이 히스토그램은 각 오버레이에서 측정된 역가를 보여줍니다.

본 절차를 수행할 때 모든 바이러스는 서로 다르며, 다른 세포 유형의 활용, 배양 시간 및 성장 배지의 변경을 포함한 최적화 과정이 필요할 수 있다는 점을 유념하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청하고 나면 액체 및 반고체 오버레이를 모두 이용한 기본적인 플라크 분석법(plaque assay) 수행 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.