고도로 정제 된 고밀도 지단백질에서의 miRNA의 높은 넣어 관통 분리에 대한 신속하고 단순화 된 방법

이 방법의 전반적인 목표는 마이크로 RNA 분석을 위해 인간 혈장에서 정제된 고밀도 지단백질을 신속하게 분리하는 단순화된 접근 방식을 개발하는 것입니다. 이 방법은 고밀도 지단백질의 분자 메커니즘 및 보호 기능에 대한 이해와 같은 간학 및 심장학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 몇 가지 주요 장점은 정제된 HDL 마이크로 RNA가 짧은 시간 내에 더 적은 양의 샘플에서 사전 분리된다는 것입니다.

이 프로토콜에서 혈장은 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 여러 원심분리 단계를 통해 공복 말초 정맥 혈액 샘플에서 얻습니다. 플라즈마를 새 튜브로 옮깁니다. 그리고 제조업체의 지침에 따라 실온에서 농도계를 사용하여 플라즈마의 밀도를 측정합니다.

마이크로 RNA 오염원이 되는 순환 엑소좀을 제거하려면 혈장 1ml에 엑소좀 침전 용액 252마이크로리터를 첨가합니다. 그리고 섭씨 4도에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 혼합물을 30분 동안 원심분리하여 엑소좀을 펠릿으로 만듭니다.

생성된 상등액 1ml를 폴리카보네이트 두께의 벽으로 된 초원심분리기 튜브로 옮겨 추가 처리를 위해 다음 비디오 세그먼트에서 시연할 수 있습니다. 고밀도 지단백질(HDL)의 분리는 초저밀도 지단백질(VLDL), 저밀도 지단백질(LDL) 및 HDL의 순차적 분리를 포함하는 3단계 밀도 구배 초원심분리 프로토콜에 의해 수행됩니다. 세 가지 다른 밀도 용액, A, B 및 C는 프로토콜 텍스트에 설명된 절차에 따라 신선하게 준비해야 합니다.

6.5ml 두께의 폴리카보네이트 벽으로 된 초원심분리기 튜브에 1ml의 플라즈마와 200마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 Fat Red 7B를 혼합합니다. 그런 다음 혼합물 위에 5ml의 용액 A를 조심스럽게 겹쳐 놓습니다. 필요한 경우 용액 A 위에 Fat Red 7B를 추가하여 각 튜브의 무게 균형을 맞춥니다.

미리 냉각된 로터에 튜브를 로드합니다. 로터를 바닥 원심분리기에 넣고 2시간 동안 원심분리기를 사용합니다. 실행이 끝나면 두 개의 레이어가 표시되어야 합니다.

VLDL 분수를 나타내는 맨 위 층의 1.5 밀리리터를 제거합니다. 그리고 섭씨 4도로 보관하십시오. 피펫을 사용하여 튜브 바닥에서 새 50ml 튜브로 4ml를 옮깁니다.

여기에는 LDL 및 HDL 분획이 포함됩니다. 다음 단계는 LDL을 분리하는 것입니다. 2ml의 용액 B와 100마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 Fat Red 7B를 LDL 및 HDL 분획이 들어 있는 튜브에 혼합합니다.

5분에서 10분 동안 얼음 위에 올려 놓는다. 6.5ml의 혼합 샘플을 폴리카보네이트 두께의 벽으로 된 초원심분리기 튜브에 넣습니다. 미리 냉각된 로터에 튜브를 넣고 3시간 동안 원심분리합니다.

원심분리가 완료되면 LDL 분율을 나타내는 상층의 1.5ml를 제거하고 섭씨 4도를 유지합니다. HDL 분획이 포함된 튜브 바닥에서 4ml를 50ml 멸균 튜브로 옮깁니다. 세 번째 단계는 HDL을 분리하는 것입니다.

용액 C 2밀리리터, 뉴클레아제가 없는 팻 레드 7B 100마이크로리터, 98% 베타 메르캅토에탄올 15마이크로리터를 HDL 분획이 포함된 튜브에 혼합합니다. 혼합물의 밀도를 확인하십시오. 미리 냉각된 로터에 튜브를 넣고 3시간 동안 원심분리합니다.

그런 다음 HDL 분율을 나타내는 최상층의 2밀리리터를 제거하고 섭씨 4도를 유지합니다. 후속 아가로스 겔 전기영동 및 PCR에 대한 간섭을 피하기 위해 지단백질 분획에서 과도한 염을 제거해야 합니다. 이 비디오에서는 HDL 분획에 대해서만 탈염 및 농축을 시연합니다.

HDL 분획에 13ml의 차가운 PBS를 추가하고 분자량 컷오프가 10K인 원심 필터 장치로 옮깁니다. 스윙 버킷 로터에서 4000배 g, 섭씨 4도에서 30분 동안 원심분리기를 사용합니다. 13ml의 차가운 PBS를 사용하여 HDL 분획을 두 번째로 탈염하고 이전과 같이 원심분리합니다.

원심분리 후, 용질이 함유된 지단백질을 제거하고 섭씨 4도를 유지하세요. 분리된 지단백질의 품질과 순도를 평가하기 위해 크기 참조로 포함된 인간 지단백질 표준물질을 사용하여 아가로스 겔 전기영동을 수행했습니다. 베타 메르캅토에탄올을 사용하지 않은 분리의 대표적인 결과는 HDL 분획에 VLDL에 대한 오염이 없으며 전형적인 알파 이동성을 나타내는 것으로 나타났습니다.

그러나 HDL 분획은 지단백질의 오염으로 인한 베타 이동성의 흔적도 보여줍니다. 마지막 원심분리 단계에서 용액 C에 베타 메르캅토에탄올을 첨가하면 HDL 분획에서 모든 오염 지단백질을 효과적으로 제거할 수 있습니다. 이 방법으로 정제된 인간 HDL에 탑재된 마이크로 RNA의 정량화 가능성을 입증하기 위해 두 개의 서로 다른 마이크로 RNA를 실시간 정량 PCR로 증폭했습니다.

이러한 증폭 플롯에서 수평선은 검출 임계값을 나타냅니다. 6개의 샘플에서 얻은 분리된 HDL의 대표적인 real-time PCR 데이터는 두 마이크로 RNA의 일관된 검출을 보여주었습니다. 마지막으로, 용융 곡선 분석은 두 마이크로 RNA에 대해 뚜렷한 단일 피크를 명확하게 보여주며, 이는 이전 PCR의 특정 증폭과 일치합니다.

이 기술을 숙달하면 제염 절차와 함께 9시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 항상 섭씨 4도에서 8도에서 작업하는 것이 중요합니다. 그리고 초원심분리 전에 각 지단백질 분획의 밀도를 조정합니다.

이 절차에 따라 HDL의 순도와 같은 추가 질문에 답하기 위해 전자 현미경과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술을 통해 대사 증후군 분야의 연구자들은 지방간 질환이 의심되는 인간에서 HDL 관련 마이크로 RNA를 바이오 마커로 탐구할 수 있습니다. 또한 HDL의 기능과 HDL이 세포 생물학을 변화시키는 분자 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 사용될 수 있습니다.