대량 세포 계측법 분석을위한 샘플 준비

이 시료 전처리 공정의 전반적인 목표는 다양한 시료에 대해 강력하고 일관된 항체 염색을 생성하여 이질적인 세포 집단을 조사할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 복잡한 이종 세포 집단에서 세포 식별, 세포 신호 전달 및 세포 반응에 대한 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 세포 수준에서 높은 매개 변수 단백질 수준을 측정할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 것은 우리 연구실의 대학원생인 Aundrietta Duncan이 될 것입니다. 각 단일 세포 현탁액 샘플에 대해 무혈청 배지에서 밀리리터당 6번째 세포까지 10배의 4배로 다시 현탁시키고, 6개의 세포에 2/10당 새로 준비된 50마이크로몰 시스플라틴 500마이크로리터를 첨가하고, 실온에서 일정한 혼합으로 오비탈 셰이커에서 샘플을 배양합니다. 1분 후, 동일한 양의 세척 버퍼로 시스플라틴을 담금질하고 세포를 원심분리합니다.

상층액을 버리고 500마이크로리터의 세척 버퍼를 추가하고 세포를 원심분리한 다음 세척 버퍼를 부어 샘플을 두 번 더 세척합니다. 그런 다음 500 마이크로 리터의 PBS를 두 번 세척하여 샘플을 유사하게 원심 분리하고 상층액을 버립니다. 두 번째 PBS 세척 후 펠릿을 500마이크로리터의 새 PBS에 다시 현탁시키고 500마이크로리터의 4%PFA로 셀을 고정합니다.

혼합할 세포를 피펫으로 만듭니다. 그런 다음 실온에서 15분 동안 지속적으로 혼합하면서 샘플을 오비탈 셰이커에 놓습니다. 배양이 끝나면 원심 분리로 세포를 펠렛화하고 상층액을 붓고 신선한 PBS로 세척합니다.

세포를 투과시키려면 세포를 다시 스핀다운하고 상층액을 버리십시오. 잔류 PBS에 있는 샘플을 완만한 와류로 다시 현탁시키고, 즉시 부드러운 피펫팅으로 6번째 세포에 2/10 10 100% 메탄올 1밀리리터를 첨가합니다. 샘플을 4도에서 최소 1시간 동안 배양하고 배양이 끝나면 세포를 원심분리합니다.

그 후, 메탄올을 붓습니다. 그런 다음 메탄올 1밀리리터당 1밀리리터의 세척 버퍼로 펠릿을 세척한 다음 500마이크로리터의 새 세척 버퍼로 두 번 더 세척합니다. 50마이크로리터로 설정된 200마이크로리터 피펫을 사용하여 각 펠릿의 나머지 세척 버퍼를 적절한 해당 항체 칵테일의 튜브로 옮깁니다.

피펫은 플런저를 부분적으로 누른 상태로 유지하여 팁으로 공기를 끌어들이지 않고 결합된 용액을 백업합니다. 그런 다음 플런저를 해제하지 않고 500마이크로리터의 세척 버퍼가 들어 있는 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 피펫 팁을 옮깁니다. 플런저를 해제하고 총 항체 칵테일 부피가 50마이크로리터인 세척 버퍼를 끌어올리고 부드러운 피펫팅으로 흡입된 항체 칵테일로 적절한 해당 샘플에 라벨을 부착합니다.

실온에서 1시간 동안 계속 흔들어 샘플을 네 번 세척하고 매번 세척 버퍼를 붓습니다. 세포를 이리듐으로 라벨링하려면 최종 펠릿을 500마이크로리터의 PBS에 다시 현탁시킨 다음 실온에서 15분 동안 4% PFA 500마이크로리터를 첨가합니다. 다음으로, 갓 준비한 62.5 나노몰 이리듐 500마이크로리터와 PFA를 샘플에 첨가하여 실온 쉐이킹을 15분 더 합니다.

그런 다음 세포를 원심분리하고 상층액을 붓고 500마이크로리터의 0.1% BSA와 여과된 탈이온수를 두 번 세척합니다. 샘플 플레이트의 well에 normalization beads를 추가하고, 이 well에 세포를 피펫팅한 다음 24시간 이내에 질량 세포 분석을 수행하여 샘플을 분석합니다. 신호 강도의 정규화 후, 이리듐 191 positive bead negative population에 게이팅을 통해 데이터에서 calibration bead를 제거할 수 있습니다.

그런 다음 단일 세포 이벤트를 게이트하여 이벤트 길이에 대한 이리듐 193 음성 발현의 이축 플롯을 사용하여 파편과 세포 다중항을 제거할 수 있습니다. 시스플라틴 라벨링은 세포 깊이의 양을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 여기서는 dead cell의 양이 적고 많은 샘플이 표시됩니다.

죽은 세포는 백금 198 양성 집단을 게이팅하여 제거할 수 있으며, 바코드를 사용하면 바코드 매개변수 내에서 샘플을 뚜렷하게 분리하여 세포를 원래 샘플 ID에 할당할 수 있습니다. IDU 라벨링은 여기에서 관찰된 미국 얼굴 세포를 감지하는 데 사용할 수 있습니다. 초기 정규화, 바코드 제거 및 게이팅 후 SPADE 알고리즘을 사용하여 고차원 데이터를 분석하여 시각적 해석에 더 적합한 데이터의 저차원 표현을 생성할 수 있습니다.

이 기술은 일단 숙달되면 제대로 수행되면 4-6시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 세척 단계를 수행하는 동안 샘플 손실을 최소화해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 질량 세포 분석을 위한 시료를 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

아지드화나트륨으로 작업하는 것은 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행할 때 적절한 PPE를 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.