이중 마커를 이용한 모자이크 분석을 이용한 대뇌 피질 개발의 계보 추적 및 클론 분석(MADM)
2020년 5월 8일
이중 마커(MADM)를 이용한 모자이크 분석을 이용하여 단일 세포 수준에서 후보 유전자의 계보 추적 및 기능성 유전자 분석을 수행하는 프로토콜이 제시된다. MADM 클로날 분석은 개별 전조자와 그들의 딸 세포의 증식 행동, 세포 출력 및 혈통 관계를 측정하는 정량적인 틀을 제공합니다.
이중 마커 기술을 이용한 모자이크 분석은 개인 줄기 세포의 증식 거동 및 저장고 출력에 대한 고정량적 정보를 제공할 수 있는 강력한 방법입니다. 이 기술의 독특한 특징은 단일 세포 수준에서 후보 유전자의 혈통 추적 및 기능적 유전 분석을 허용한다는 것입니다.절차에 악마화, 카르멘 Streicher, 기술자, 니콜 앰버지, 포스트 닥터, 기젤 청, 포스트 닥터와 앤디 한센, 내 실험실에서 박사 과정 학생. 실험마우스에서 MADM 재결합 이벤트를 유도하려면 25게이지 바늘을 장착한 1ml 주사기를 사용하여 임신 한 댐에 맞춰 타목시펜 인트라페리토날의 단일 주사를 전달한다. MADM 클로날 분석부터 산후 시간 점에 이르기까지. 배아 일 18 받는 일 18 받는 날, 수핀 위치에 임신 한 마우스를 배치 하 고 70%에탄올모피를 소독. 자궁 위의 하복부에 있는 피부에 있는 작은 절개를 하고 복막을 드러내기 위하여 근육과 복부 근육 벽을 통해 두 번째 절개를 합니다. 가위를 사용하여 자궁을 주변 조직으로부터 분리하고 온수 자궁을 따뜻한 물로 장갑에 넣습니다. 그런 다음 미세 팁 가위와 손가락을 사용하여 자궁 벽을 조심스럽게 열어 배아를 방출합니다. 새끼를 부드럽게 누르고 수시로 호흡을 시작한 후 산전 동물을 위탁 모에게 옮기십시오. 신경 MADM 클론 티슈를 수집하기 위해 관류 수술 트레이에 수핀 위치에 마취 된 동물을 배치하고 70 %의 에탄올로 모피를 소독합니다. 가위와 집게를 사용하여 피부를 통해 하나의 절개와 근육 층을 통해 하나의 절개를합니다. 흉부 구멍이 보이면, 냄새를 맡고 다이어프램을 들어 올려 심장을 드러내고 조심스럽게 갈비뼈를 수술 트레이에 고정합니다.PBS로 채워진 연설 펌프 튜브에 연결된 바늘을 심장의 왼쪽 아래 심실로 삽입하고 작은 아이리스 가위를 사용하여 오른쪽 의 후방 끝에 절개를 합니다. PBS와 심장 혈관 시스템을 perfuse 즉시 PBS에서 갓 준비 얼음 차가운 4 % 파라 포름알데히드와 관류에 의해 다음. 관류가 완료되면 신중한 해부를 통해 뇌를 제거하고 수확 한 장기를 신선한 4 %의 뇌 부피의 적어도 5 배에 배치합니다 4
개요
본 연구는 Mosaic Analysis with Double Markers (MADM)를 이용하여 단일 세포 수준에서 후보 유전자의 계보 추적 및 기능적 유전자 분석을 수행하는 프로토콜을 제시합니다. MADM 클론 분석을 통해 개별 전구세포와 그 후손 세포의 증식 행동 및 세포 생성량을 정량적으로 측정할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
연구 분야
- 계보 추적
- 유전자 분석
- 줄기세포 생물학
배경
- MADM 기술은 세포 증식을 이해하는 데 유용합니다.
- 이 방법은 단일 세포 수준에서의 추적이 가능하게 합니다.
- 적용 분야로는 세포 출력물 및 계보 관계 평가가 포함됩니다.
사용된 방법
- 이중 표지 모자이크 분석 (MADM)
- 실험 모델: 생쥐
- 기술 항목에는 복강 내 주사와 조직 관류가 포함됨.
주요 결과
- 전구세포 행동의 세밀한 조사를 가능하게 함.
- 딸세포의 계통 관계에 대한 통찰력을 제공함.
- 기능적 유전자 분석을 위한 신뢰할 수 있는 방법을 입증함.
결론
- 본 연구는 유전 분석에서 MADM을 활용하기 위한 종합적인 프로토콜을 제공합니다.
- 이러한 결과는 발생 생물학 분야에 크게 기여합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
이중 표지 모자이크 분석(Mosaic Analysis with Double Markers, MADM)은 발달 중인 대뇌 피질에서 전례 없는 단일 세포 수준의 해상도로 계보 추적 및 클론 분석을 가능하게 하며, 신경 줄기세포의 운명과 분열 패턴을 매핑하는 과제를 직접적으로 해결합니다. 이러한 역량은 초기 신경 발달 표적 검증의 예측 신뢰도를 높이며, 중추신경계(CNS) 포트폴리오 결정 시 기전적 리스크를 완화하는 데 도움을 줍니다. MADM의 정량적 및 정성적 결과물은 이를 신경생물학 중심의 R&D 파이프라인 내 기능적 유전학 조사를 위한 핵심 도구로 자리 잡게 합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 신경 줄기세포의 계보 전환 및 분열 모드에 대한 정밀한 분석을 가능하게 합니다.
- 신경 발달 경로 내 후보 유전자의 기능적 검증을 지원합니다.
- in vivo에서 대조군과 돌연변이 서브클론을 구분함으로써 기전적 리스크 제거(de-risking)를 제공합니다.
- 중추신경계(CNS) 치료제 프로그램의 신뢰도 높은 타겟 선정을 용이하게 합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 후속 표현형 스크리닝을 위해 검증된 단일 세포 계통 지도를 생성합니다.
- 전구 세포의 증식 및 운명 결정에 대한 재현 가능하고 정량적인 판독값을 제공합니다.
- 동일한 조직 환경 내에서 비교 분석을 가능하게 하여 분석법의 표준화를 지원합니다.
- 신경 발달 맥락에서 화합물 평가를 위한 견고한 생물학적 시스템을 구축합니다.
중개 및 전임상 연구
- 계보 추적 결과를 질병 관련 신경 회로 형성과 연계합니다.
- 발견 단계의 유전자 조작부터 전임상 모델 검증까지의 연속성을 가능하게 합니다.
- in vivo 기능적 근거를 바탕으로 CNS 타겟의 리스크 조정된 진전을 지원합니다.
- 신경 전구세포의 클론 분석을 통해 중개 바이오마커 인사이트를 제공합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
MADM 기반의 계보 추적은 CNS 중심 파이프라인에서 초기 발견부터 리드 화합물 식별 및 전임상 검증까지 통합적으로 적용됩니다.
- 발견 생물학: 신경 줄기세포의 운명 및 분열 패턴에 대한 고해상도 가설 검증을 제공합니다.
- 스크리닝: 분석법 개발 및 화합물 스크리닝을 위한 정량적이고 재현 가능한 계보 데이터를 제공합니다.
- 분석: 대조군과 돌연변이 전구세포의 거동을 비교하기 위한 광학 및 통계적 결과물을 제공합니다.
- 중개 연구: 생체 내(in vivo) 계보 결과를 매핑함으로써 발견 단계의 연구 결과를 전임상 모델로 연결합니다.
- 기업적 재사용: 적절한 CreERT2 드라이버가 있는 모든 마우스 줄기세포 틈새(niche)에 적용 가능하여 플랫폼 확장성을 지원합니다.
운영 및 기업적 영향
- 과학적 가치: 신경 계보 연구에서 예측 신뢰도를 높이고 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 재현성과 확장성을 위해 계보 추적 및 클론 분석 워크플로우를 표준화합니다.
- 전략적 가치: CNS 포트폴리오에서 go/no-go 결정에 정보를 제공하고 후기 단계의 생물학적 리스크를 감소시킵니다.
- 포트폴리오 영향: in vivo 기능적 데이터에 기반하여 신경 발달 표적의 리스크 조정 우선순위 설정을 가능하게 합니다.
구현 시 고려 사항
- 유전자 조작, in vivo 계보 추적 및 신경해부학적 박제에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- CreERT2 드라이버가 포함된 마우스 모델과 고급 이미징 인프라에 대한 접근이 필요합니다.
- 재현 가능한 클론 분석 및 데이터 해석을 위해 팀 간의 표준화가 필수적입니다.
- 적절한 유전자 드라이버와 조직 처리 프로토콜을 통해 다양한 줄기세포 니치(niche)에 적용 가능합니다.
- 유전자 도구 및 조직 접근이 가능한 마우스 시스템으로 제한됩니다.
바이오제약 FAQ
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:49
Tamoxifen (TM) Induction in Mosaic Analysis with Double Markers (MADM) Mice
2:00
MADM Clone Brain Tissue Harvest
3:12
MADM Brain Tissue Sectioning
4:30
Adult Tissue Mounting
5:29
Confocal Image Acquisition and MADM Clone Quantification
6:29
Serial 3D Clone Reconstruction
7:30
Results: Representative Lineage Tracing and Clonal Analysis
8:41
Conclusion
