형광 이미징을 사용한 Jurkat 발현 키메라 항원 수용체의 신속한 체외 세포 독성 평가
2023년 10월 27일
단일 종양 항원을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 Jurkat 세포에 의한 정량적 종양 세포 사멸을 평가하기 위한 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 말초 혈액 유래 T 세포에서 확인하기 전에 CAR hinge 구조를 신속하게 최적화하기 위한 스크리닝 플랫폼으로 사용할 수 있습니다.
CAR T세포는 인체 임상시험에서 더 나은 반응을 얻기 위해 지속적으로 개선되고 있습니다. 우리는 형광 이미징을 사용하여 가장 잘 작동하는 조합을 스크리닝하는 것과 같은 편향되지 않은 고처리량 방법을 사용하여 실험실에서 이를 평가하는 방법을 찾고 있습니다. 세포외 및 힌지 도메인의 기하학적 구조를 수정하여 임의의 단일 사슬 가변 단편에 대해 설계할 수 있는 구성물의 여러 조합이 있습니다.
이 프로토콜은 Jurkat 세포를 사용하여 표적 세포를 제거하는 데 가장 효과적인 조합을 식별하기 위해 설계되었습니다. 이는 Jurkat 세포를 사용하여 표적 세포 독성을 기반으로 CAR 구조를 스크리닝하기 위한 빠르고 처리량이 높은 프로토콜로, 기존 T 세포로 검증됩니다. 이 기술을 사용하여 12개의 서로 다른 CAR 구조를 96웰 플레이트에서 동시에 테스트할 수 있습니다.
Akhavan Lab에서는 여러 CAR 구조를 스크리닝하기 위해 높은 처리량 방식으로 Jurkat 세포를 발현하는 CAR에 의한 표적 세포의 직접 순환을 절대적인 수로 정량화합니다. 우리 실험실의 주요 목표는 고급 뇌종양에 대한 CAR T 세포 요법의 임상 번역을 개선하는 것입니다. 당사는 CAR T 세포 세포 독성을 개선하고 종양 미세환경을 표적으로 삼기 위한 하나의 양식으로 고처리량 약물 스크리닝을 활용합니다.
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개요
본 프로토콜은 CAR를 발현하는 Jurkat 세포의 종양 세포에 대한 세포독성을 평가하는 고처리량 방법을 설명합니다. 이를 통해 다양한 CAR 구성물을 신속하게 스크리닝하여 특정 종양 항원을 표적으로 하는 가장 효과적인 조합을 식별할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 면역학
- 암생물학
- 세포 치료
배경
- 임상 결과 개선을 위해 CAR T 세포가 정밀하게 최적화되고 있습니다.
- CAR 구조물을 최적화하는 데 있어 고처리량 스크리닝 방법이 필수적입니다.
- Jurkat 세포는 CAR 효능을 평가하기 위한 모델로 사용됩니다.
- 본 연구는 표적 세포에 대한 CAR 구조물의 세포독성에 초점을 맞춥니다.
연구 목적
- CAR 컨스트럭트를 효율적으로 스크리닝하기 위한 프로토콜을 개발합니다.
- CAR를 발현하는 Jurkat 세포의 세포독성 효과를 정량화합니다.
- 종양 항원을 표적으로 하는 최적의 CAR 구성을 확인합니다.
사용된 방법
- 고속 대량 스크리닝을 위한 형광 이미지 분석.
- 96-웰 플레이트 형식에서의 다중 CAR 구조체 평가.
- CAR 발현 Jurkat 세포에 의한 표적 세포 사멸 정량화.
- 검증을 위한 기존 T 세포 반응과의 비교.
주요 결과
- 종양 세포 사멸에 효과적인 CAR 구조체 식별.
- Jurkat 세포를 이용한 고처리량 분석 능력 입증.
- 다양한 구조체 간의 세포독성 정량적 평가.
- 임상 적용 전 CAR 설계의 신속한 최적화 가능성.
결론
- 이 프로토콜을 통해 CAR 컨스트럭트를 효율적으로 스크리닝할 수 있습니다.
- Jurkat 세포는 CAR 효능을 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 모델을 제공합니다.
- 이 접근 방식은 CAR T 세포 치료제 개발을 가속화할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
Jurkat 세포에서 CAR 구조체의 신속하고 고처리량인 세포독성 평가를 통해, 리소스 집약적인 일차 T 세포 검증 이전에 초기 단계의 리스크 감소와 CAR 설계의 우선순위 설정이 가능합니다. 이 플랫폼은 탁월한 표적 세포 살해 능력을 갖춘 힌지 최적화 CAR의 식별을 가속화하여, 종양학 세포 치료제 파이프라인의 효율적인 포트폴리오 선별을 지원합니다. 여러 구조체의 세포독성을 동시에 정량화함으로써, 연구팀은 중요한 발견 전환점에서 데이터 기반의 의사결정을 내릴 수 있습니다.
바이오제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 표적 검증
- 기능적 표적 검증을 위해 CAR 구성체 변형 조합을 신속하게 분석할 수 있습니다.
- 제어된 시스템에서 직접적인 세포 독성을 정량화함으로써 기전적 위험 요소를 제거할 수 있습니다.
- 1차 T 세포 엔지니어링에 앞서 구성체 선택에 대한 예측 신뢰도를 높여줍니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 후속 고처리량 스크리닝 워크플로우를 위해 검증된 CAR-Jurkat 시스템을 준비합니다.
- 정량적 형광 이미징 출력을 통해 세포독성 분석을 표준화합니다.
- 여러 CAR 구조물을 병렬적으로 재현 가능하고 확장 가능한 방식으로 평가할 수 있습니다.
- 96-웰 플레이트 형식에서 화합물 또는 구조물의 신뢰성 있는 평가를 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- PBMC 유래 T 세포에서 연구 결과를 확인함으로써 초기 세포독성 데이터를 중개 연구 목표와 일치시킵니다.
- 발견 단계의 컨스트럭트 최적화부터 전임상 검증 단계까지의 연속성을 제공합니다.
- 최적화되지 않은 CAR 설계를 조기에 걸러냄으로써 후기 단계에서의 탈락 위험을 줄입니다.
파이프라인 및 워크플로 통합
이 고처리량 세포독성 플랫폼은 초기 발견과 리드 물질 식별 단계의 접점에 위치하여, 구성물 설계와 전임상 검증 사이를 연결합니다. 이를 통해 자원 소모가 많은 1차 T 세포 연구나 in vivo 연구로 진행하기 전에 신속한 가설 검증 및 구성물 선별이 가능합니다.
- 발견 생물학: CAR 효능을 위한 힌지 및 세포 외 도메인 수정에 대한 가설 기반 평가를 지원합니다.
- 스크리닝: 컨스트럭트 비교 및 순위 결정을 위한 정량적이고 재현 가능한 세포 독성 데이터를 제공합니다.
- 분석: 의사 결정의 근거가 되는 절대 세포 수 및 통계적 결과(예: 일원 분산 분석/one-way ANOVA)를 제공합니다.
- 중개 연구: PBMC 유래 T 세포에서 컨스트럭트 성능을 확인하여 중개 연구의 연속성을 지원합니다.
- 기업적 재사용: 지속적인 CAR 컨스트럭트 최적화 캠페인을 위한 확장 가능하고 재사용 가능한 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: CAR 구조체 선택 시 예측 신뢰도를 높이고 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 세포독성 평가를 표준화하고 규모를 확장하여 효율적인 자원 배분을 가능하게 합니다.
- 전략적 가치: 구조체를 조기에 필터링함으로써 go/no-go 결정 및 자본 효율성을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 위험 조정 우선순위 설정 및 CAR 후보 물질의 추진을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- CAR 구조 설계 및 Jurkat 세포의 렌티바이러스 형질전환에 관한 전문 지식이 필요합니다.
- 정량적 판독을 위한 형광 이미지 분석 장비 및 분석 소프트웨어 접근 권한이 필요합니다.
- 어세이 설정 및 데이터 분석 파라미터에 대한 팀 간 표준화가 요구됩니다.
- 다른 세포 모델 또는 항원에 적용할 경우 프로토콜 최적화가 필요할 수 있습니다.
- 구조체 비교를 위해 견고한 통계 분석(예: ANOVA)이 뒷받침되어야 합니다.
바이오 제약 FAQ
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:42
Plating CFSE‐Labelled Tumor Cells and Co‐Culturing CAR‐Expressing Jurkats for In Vitro Cytotoxicity Evaluation
5:19
Preparation of Plate for Fluorescent Imaging and Cell Viability Assessment in CAR‐Jurkat Co‐Culture with CFSE‐Labeled Tumor Cells
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